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作者：張國(guó)英 楊慧 劉明社 張蕓 趙中夫 【關(guān)鍵詞】 陽(yáng)離子脂質(zhì)體META;HepG2細(xì)胞;RNA干擾;AFP 摘 要 目的:篩選較理想的陽(yáng)離子脂質(zhì)體META/pGenesil-AFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2的方法。方法:將針對(duì)兩條靶序列AFP1和AFP2的shRNA的DNA模板雙鏈，連接于質(zhì)粒表達(dá)載體，構(gòu)建質(zhì)粒載體pGenesil-1-AFP1（含綠色熒光蛋白GEP編碼序列）及pGenesil-2-AFP2，用陽(yáng)離子脂質(zhì)體META/質(zhì)粒載體pGenesil-1-AFP1轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞。熒光顯微鏡觀察并計(jì)算不同劑量配比的脂質(zhì)體/質(zhì)粒載體混合液轉(zhuǎn)染效果及微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測(cè)不同劑量配比轉(zhuǎn)染后對(duì)AFP基因表達(dá)的影響。結(jié)果:劑量比為8μL∶2.5μg條件，能有效地轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，并有效抑制AFP表達(dá)且無(wú)細(xì)胞毒性作用。結(jié)論:本研究成功建立了陽(yáng)離子脂質(zhì)體META/質(zhì)粒載體pGenesil-1-AFP1轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方法。 關(guān)鍵詞 陽(yáng)離子脂質(zhì)體META;HepG2細(xì)胞;RNA干擾;AFP 近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的RNA干擾技術(shù)（RNAi）被認(rèn)為是最有效基因敲除方法。實(shí)施siRNA對(duì)靶序列的抑制，成功地將雙鏈RNA轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)是實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵。本研究將針對(duì)兩條靶序列AFP1和AFP2的shRNA的DNA模板雙鏈，連接于質(zhì)粒表達(dá)載體，構(gòu)建質(zhì)粒載體pGenesil-1-AFP1（含綠色熒光蛋白編碼序列）及pGenesil-2-AFP2，用陽(yáng)離子脂質(zhì)體META/質(zhì)粒載體pGenesil-1-AFP1對(duì)HepG2細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)研究，擬篩選較理想的陽(yáng)離子脂質(zhì)體META/pGenesil-1-AFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2的方法。 1 材料與方法 1.1 材料 高糖型DMEM培養(yǎng)基由美國(guó)GIBCO公司提供;胎牛血清由杭州四季青生物制品公司提供;L-谷氨酰胺由北京化學(xué)試劑公司提供;META-FECTENE 轉(zhuǎn)染試劑由德國(guó)BIONTEX提供;質(zhì)粒載體pGenesil-1-AFP1、pGenesil-2-AFP2由武漢晶賽生物工程有限公司協(xié)助合成;AFP化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒由美國(guó)BECKMEN提供;人肝癌細(xì)胞HepG2由北京大學(xué)感染科病毒研究室惠贈(zèng)，本室傳代。 1.2 方法 1.2.1 目標(biāo)基因序列的選擇及載體構(gòu)建:以人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞AFP基因作為作用靶點(diǎn)（geneID:174），合成兩條AFP-shRNA，分別為 AFP-1，AFP-2，經(jīng)BLAST軟件查對(duì)及序列同源性分析，確定目標(biāo)基因序列為:AFP-1:1275i-GCATTG- GCAAAGCGAAGCT-，AFP-2:694i-GCAGCU-UGUUAAAUCAACA-陰性對(duì)照（HK）:-GACTTCATAAGGCGCATGC-，構(gòu)建質(zhì)粒載體pGe-nesil-1-AFP1插入的DNA模板序列（包含GFP編碼 序列）:5′- GATCCGCATTG-GCAAAGCGAAGCTTTCAAGACGAGCTTCGCTTT-GCCAATGCTTTTTTGTCGACA-3′ ，3′-GCGTAAC-CGTTTCGCTTCGAAAGTTCTGCTCGAAGCGAAAC GGTTACGAAAAAAC AGCTGTTCGA-5′，構(gòu)建質(zhì)粒載體pGenesil-2-AFP2插入的DNA模板序列為: 5′ - GATCCGGTCTTACA-TAAGAGGACTTTCAAGACGAGTCCTCTTATGT AA-GACCTTTTTTGTCGACA-3′，3′-GCCAGAATG-TATTCTCCTGAAAGTTCTGCTCAGGAGAATACATT CTGGAAAAAACAGCTGTTCGA-5′，構(gòu)建質(zhì)粒載體pGenesil-2-HK插入的DNA模板序列為:5′ -GATCCGACTTCATAAGGCGCATGCTTCAAGACG-GCATGCGCCTTATGAAGTCTTTTTTGTCGACA-3′ ，3′-GCTGAAGTATTCCGCGTACGAAGTTCTGCC GTACGCGGAATACTTCAGAAAAAACAGCTGTTCGA-5′，載體質(zhì)粒的構(gòu)建及酶切鑒定、DNA序列分析由武漢晶賽生物工程公司協(xié)助完成，濃度為2.5μg/μL。 1.2.2 待轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞的培養(yǎng)和準(zhǔn)備:HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)于含10%胎牛血清的高糖型DMEM培養(yǎng)基中，并在37℃、5%CO 2 孵箱中進(jìn)行培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用0.25%胰酶-0.02%EDTA消化后吹打成單細(xì)胞懸液，以4×10 5 密度轉(zhuǎn)種于放置了無(wú)菌蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中，每孔2mL。24h后觀察細(xì)胞生長(zhǎng)，鋪滿孔底面積約60%時(shí)用于轉(zhuǎn)染。 1.2.3 轉(zhuǎn)染試劑META/質(zhì)粒載體混合液配制及轉(zhuǎn)染:劑量配比在其建議范圍（2∶1～7∶1）內(nèi)選擇設(shè)計(jì)，按META/pGenesil配比分六組，分別為空白對(duì)照組，3μL∶1μg組，6μL∶1μg組，8μL∶2.5μg組，12μL∶2.5μg組，15μL∶5μg組，每組設(shè)三個(gè)復(fù)孔。用 pGenesil-1-EGFP-AFP1進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以便熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果。 取10支無(wú)菌1.5mL EP管，作好標(biāo)記:取9μL，18μL，24μL，36μL，45μL脂質(zhì)體分別加入A1，A2，B1，B2，C1管中;迅速加入無(wú)抗生素?zé)o血清的 DMEM培養(yǎng)基，使得各管中總體積為300μL，輕輕混勻。a1，a2管中各加1.2μL pGenesil-1-EGFP-AFP1;b1，b2管中各加3μL;c1管中加6μL;然后各管中迅速加入無(wú)抗生素及血清的DMEM培養(yǎng)基，使得各管中總體積為300μL，混勻。將管A1、A2、B1、B2、C1中的脂質(zhì)體對(duì)應(yīng)加入a1、a2、b1、b2、c1管中，輕輕混勻。室溫下靜置20min。取出培養(yǎng)板將板中培養(yǎng)液棄去，用無(wú)血清及抗生素的DMEM培養(yǎng)基沖洗培養(yǎng)板兩次后，留出三孔作為空白對(duì)照，每孔加1mL無(wú)血清及抗生素的DMEM培養(yǎng)基，其余各孔各加0.8mL。除空白對(duì)照外，每三孔加入相同劑量配比的META-pGene復(fù)合物各200μL，混勻。將培養(yǎng)板置于CO 2 孵箱中培養(yǎng)8h后，吸出孔中DMEM，每孔加入含10%胎牛血清的完全DMEM繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后吸出細(xì)胞培養(yǎng)上清液，將蓋玻片用PBS洗滌兩次后置于熒光顯微鏡下觀察，記錄不同劑量配比的轉(zhuǎn)染效果。 1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中AFP的檢測(cè):轉(zhuǎn)染后24h，對(duì)各孔AFP進(jìn)行檢測(cè)。采用微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析法，美國(guó)BECKMEN公司試劑盒操作。 2 結(jié)果 2.1 不同劑量配比的META/質(zhì)粒載體混合液轉(zhuǎn)染效果熒光顯微鏡下，我們觀察到不同劑量配比的陽(yáng)離子脂質(zhì)體有不同的轉(zhuǎn)染效果，表達(dá)綠色熒光蛋白的為被轉(zhuǎn)染細(xì)胞。為了計(jì)算不同配比陽(yáng)離子 META的轉(zhuǎn)染率，在不同配比的轉(zhuǎn)染組的蓋玻片上各選擇3個(gè)視野，計(jì)數(shù)細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞的平均百分率。以此篩選RNAi實(shí)驗(yàn)的最適META/質(zhì)粒載體比例。見表1。表1 不同配比脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染率（略）在不同配比試劑的轉(zhuǎn)染組中，8μL∶2.5μg組和12μL∶2.5μg組轉(zhuǎn)染效率較高，且兩者之間無(wú)顯著性差異（P>0.05）;但顯著高于3μL∶1μg組和6μL∶1μg組（P<0.01）。因15μL∶5μg組多數(shù)細(xì)胞發(fā)生崩解呈碎片樣，無(wú)法觀察到轉(zhuǎn)染效果，未列入統(tǒng)計(jì)表中。 2.2 不同劑量配比組轉(zhuǎn)染后對(duì)AFP基因表達(dá)的影響 轉(zhuǎn)染后24h，對(duì)各孔AFP進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示與轉(zhuǎn)染率相一致的抑制作用，3μL∶1μg組和6μL∶1μg組與不做轉(zhuǎn)染的空白對(duì)照組相比，AFP含量無(wú)顯著性變化。8μL∶2.5μg組與12μL∶2.5μg組的AFP含量無(wú)明顯差別（P>0.05），但均較空白對(duì)照組和低濃度組減少（P<0.01）。見表2。 表2 不同配比轉(zhuǎn)染組對(duì)AFP表達(dá)的影響（略）根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們選用劑量配比為8μL∶2.5μg的META/質(zhì)粒載體混合液為最佳條件配比。 3 討論 哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染有多種方法 ［1］ ，在早期siRNA研究中多應(yīng)用磷酸鈣共沉淀法，但此方法轉(zhuǎn)染效率低且對(duì)很多細(xì)胞株無(wú)效。以后有人利用陽(yáng)離子脂質(zhì)體在水中可形成微小的帶正電的單層脂質(zhì)體，靠靜電作用結(jié)合到核酸分子的磷酸骨架上以及帶負(fù)電的細(xì)胞膜表面，被俘獲的核酸分子就會(huì)被導(dǎo)入細(xì)胞原理，采用陽(yáng)離子脂質(zhì)體法進(jìn)行轉(zhuǎn)染研究，此方法雖操作簡(jiǎn)便，轉(zhuǎn)染效率高，但易產(chǎn)生高水平細(xì)胞毒性 ［2］。近幾年出現(xiàn)的新一代脂質(zhì)體―多聚陽(yáng)離子脂質(zhì)體，可以濃縮DNA，將DNA運(yùn)送到細(xì)胞內(nèi)并使其在細(xì)胞核內(nèi)釋放，而且細(xì)胞毒性低，穩(wěn)定性好，轉(zhuǎn)染效率高（可達(dá)磷酸鈣沉淀法的5倍～100倍）。本實(shí)驗(yàn)中，我們將編碼siAFP的DNA模板插入pGenesil-1質(zhì)粒載體，構(gòu)建出pGenesil-1- AFP。這種質(zhì)粒以pEGFP-C1改造獲得，用陽(yáng)離子脂質(zhì)體包裹質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，被轉(zhuǎn)染細(xì)胞可以表達(dá)綠色熒光蛋白。在熒光顯微鏡下可以直接觀察到轉(zhuǎn)染成功的陽(yáng)性細(xì)胞發(fā)出明亮綠色熒光。通過(guò)計(jì)數(shù)視野中陽(yáng)性細(xì)胞和總細(xì)胞數(shù)可以計(jì)算出轉(zhuǎn)染率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同劑量的轉(zhuǎn)染試劑能將不同濃度比例的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)入細(xì)胞，以轉(zhuǎn)染試劑:質(zhì)粒載體為8μL∶2.5μg組與12μL∶2.5μg組的轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染效率最高，均可達(dá)到50%左右，兩組轉(zhuǎn)染效率無(wú)顯著差異，但后者細(xì)胞活性明顯下降，而增加轉(zhuǎn)染試劑濃度比值至15μL∶5μg組中的細(xì)胞則發(fā)生溶解，說(shuō)明多聚陽(yáng)離子脂質(zhì)體劑量過(guò)大也可能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。提示劑量比為 8μL∶2.5μg條件，能有效地轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，且無(wú)細(xì)胞毒性作用。(論文下載網(wǎng) www.lunwenda.com ) 甲胎球蛋白（AFP）是人類發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)真正有價(jià)值的腫瘤標(biāo)志物，長(zhǎng)期以來(lái)，一直認(rèn)為AFP僅可用于原發(fā)性肝癌（HCC）的診斷。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)、免疫學(xué)技術(shù)及細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究的發(fā)展，有關(guān)學(xué)者通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)AFP有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的重要生物學(xué)作用 ［3，4］ 。RNAi能高效、特異、持久抑制基因表達(dá)，對(duì)由于基因表達(dá)異常增高引起的疾病中有重要的應(yīng)用前景。先前應(yīng)用RNAi技術(shù)抑制有關(guān)基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)，大多采用體外轉(zhuǎn)錄合成siRNA或構(gòu)建siRNA表達(dá)載體與靶基因表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)染目標(biāo)細(xì)胞的方法，單獨(dú)觀察靶基因表達(dá)受抑效果，這種方法雖可以準(zhǔn)確檢測(cè)到siRNA特異地抑制基因表達(dá)作用 ［2，5，6］ 。但目前的轉(zhuǎn)染方法并不能保證試驗(yàn)體系中所有細(xì)胞均被轉(zhuǎn)染，不符合活體內(nèi)發(fā)生腫瘤的自然狀態(tài)。因此，試驗(yàn)結(jié)果距應(yīng)用研究還有一定差距。本研究以HepG2細(xì)胞為研究對(duì)象，使轉(zhuǎn)染和未被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在同一體系中培養(yǎng)，在轉(zhuǎn)染效率達(dá)50%左右后，不去除未被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，觀察AFP基因表達(dá)抑制情況。這種試驗(yàn)方案不僅比較接近機(jī)體發(fā)生腫瘤的自然狀態(tài)，而且可以更好地評(píng)價(jià)siRNA特異地抑制AFP基因表達(dá)的作用。 參考文獻(xiàn) ［1］ Shlomai A，Shaul Y.Inhibition of hepatitis B virus expression and replication by RNA interference［J］.Hepatology，2003，37（4）:764～ 770. ［2］ Giladi H，Ketzinel-Gilad M，Rivkin L，et al.Small interfering RNA inhibits hepatitis B virus replication in mice［J］.Molecular Thera-py，2003，8（5）:769～776. ［3］ Li MS，Li PF，He SPet al.Promoting molecular mechanism of alpha-fetoprotein on the 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