作者：李林 賴江華 陳利萍 朱俊艷 陳騰
【摘要】 目的 研究多巴胺D3受體對(duì)小鼠基礎(chǔ)痛閾的調(diào)制作用，為進(jìn)一步探討D3受體在痛覺調(diào)制作用中的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。方法 對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行適應(yīng)性預(yù)處理后，用甩尾儀測(cè)定D3受體基因敲除小鼠(D3-/-)及具有相同遺傳背景的野生型(C57BL/6J)小鼠的基礎(chǔ)痛閾。結(jié)果 D3受體基因敲除小鼠的基礎(chǔ)痛閾高于野生型C57BL/6J小鼠，統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)顯示兩組間有顯著性差異(P<0.05)。結(jié)論 多巴胺D3受體可能參與痛覺的調(diào)制過程，對(duì)脊髓傷害性反射具有緊張性下調(diào)易化效應(yīng)。對(duì)進(jìn)一步在分子水平探討多巴胺對(duì)痛覺調(diào)制作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】 多巴胺D3受體；基礎(chǔ)痛閾；基因敲除小鼠
腦內(nèi)多巴胺(dopamine, DA)系統(tǒng)是參與調(diào)節(jié)人類軀體運(yùn)動(dòng)、精神活動(dòng)以及精神依賴的重要遞質(zhì)[1]，隨著中樞定位分析的逐漸精確以及特異性的DA受體(dopamine receptor, DR)亞型工具藥的應(yīng)用,中樞DA系統(tǒng)在痛覺調(diào)制中的作用越來越受到重視。由于既往關(guān)于DR對(duì)痛覺調(diào)制作用的研究多是通過給予多巴胺受體激動(dòng)劑或拮抗劑來進(jìn)行的，存在特異性及靶向性不強(qiáng)等不足，因此各家報(bào)道的研究結(jié)果很不一致[2]。而多巴胺D3受體基因敲除(dopamine 3 receptor knockout, D3RKO)小鼠具有基因定向敲除后特異性高等優(yōu)勢(shì)，因此為深入研究DA受體在痛覺調(diào)制過程中的作用提供了一條新途徑。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)多巴胺D3受體基因敲除小鼠及野生型(C57BL/6J)小鼠進(jìn)行基礎(chǔ)痛閾測(cè)定來揭示多巴胺D3受體在痛覺調(diào)制過程中的作用。
1 材料與方法
1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 D3RKO小鼠(D3-/-)(由美國(guó)芝加哥大學(xué)徐明教授惠贈(zèng))以及具有相似遺傳背景的野生型(wild type, WT)C57BL/6J小鼠(由西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)各8只，雌雄各半，體重20-25g。動(dòng)物飼養(yǎng)在SPF(specificpathogen free)級(jí)動(dòng)物房，恒溫21℃。各組小鼠在層流架中分籠飼養(yǎng)，24h周期明暗交替照明,動(dòng)物自由進(jìn)食及飲水。
1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 甩尾痛覺測(cè)試儀(33 Tail Flick Analgesia Meter, ITC, USA)。
1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物預(yù)處理 在開始實(shí)驗(yàn)前2d對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行預(yù)處理。每天在同一時(shí)間和同一環(huán)境，由實(shí)驗(yàn)操作人員佩戴在實(shí)驗(yàn)小鼠鼠籠墊料中放置過的棉線手套在甩尾儀上安撫小鼠直至其保持安靜狀態(tài)，使其適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境及操作過程。
1.4 基礎(chǔ)痛閾測(cè)定 用輻射熱照射鼠尾，測(cè)定甩尾潛伏期(s)，連續(xù)3d，每天測(cè)試3次，每次間隔30s。輻射熱照射強(qiáng)度為儀器65%強(qiáng)度，照射部位為小鼠尾部下2/3處，使小鼠的甩尾潛伏期在1.5-3s間。
1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS11.5軟件對(duì)兩實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)進(jìn)行重復(fù)測(cè)量方差分析，P<0.05表示有顯著性差異。
2 結(jié)果
對(duì)資料進(jìn)行球檢驗(yàn)得近似χ2值為14.632，自由度為2，對(duì)應(yīng)P值0.001，故進(jìn)行GreenhouseGeisser 多元重復(fù)測(cè)量方差分析，結(jié)果見表1、2。
表1 D3RKO小鼠和C57BL/6J小鼠基礎(chǔ)痛閾測(cè)定結(jié)果（略）
Table 1 Baseline pain threshold of D3RKO mice and C57BL/6J mice
**P<0.01 and *P<0.05 vs. C57BL/6J group on the same day
表2 各項(xiàng)統(tǒng)計(jì)學(xué)參數(shù)（略）
Table 2 Statistical parameters
3 討論
多巴胺受體包括D1、D2、D3、D4、D5五種亞型。由于D1和D5受體分子同源性超過80%及與興奮性G蛋白(Gs)耦聯(lián)等共同特性,在藥理學(xué)特征上與傳統(tǒng)的D1亞型受體相似，因此統(tǒng)稱為D1樣受體(D1like receptors)。D2、D3和D4受體分子同源性約為45%，受體基因有4-6個(gè)內(nèi)含子，無棕櫚酸酯化作用，均與抑制性G蛋白(Gi)相耦聯(lián)，在藥理學(xué)特征上與傳統(tǒng)的D2亞型受體相似，故統(tǒng)稱為D2樣受體(D2like receptors)[3]。既往對(duì)多巴胺受體功能的研究主要是通過給予拮抗劑或激動(dòng)劑的方法進(jìn)行。對(duì)于D3受體，常用的配體有四氫萘滿類、LY171555、PD128907、(+)S14297等，是D3受體激動(dòng)劑或拮抗劑。由于D3受體與D2、D4受體結(jié)構(gòu)上高度同源，空間分布上部分重疊使得這些配體都只是部分性的激動(dòng)劑或拮抗劑，并不能起到D3受體專一性拮抗或激動(dòng)，因此就使得在此基礎(chǔ)上研究結(jié)果的可信度受到一定影響。
本實(shí)驗(yàn)所用的D3RKO小鼠是以野生型C57BL/6J小鼠為基礎(chǔ)，通過由PGK(phosphoglycerate kinase)啟動(dòng)子調(diào)控的neo(neomycin resistance)基因替代多巴胺D3受體第一外顯子以敲除D3受體基因。與野生型C57BL/6J小鼠相比，該敲除小鼠無顯著生理學(xué)異常，可以正常繁殖、生長(zhǎng)，其繁殖后代的數(shù)量、體形及性別無明顯異常。經(jīng)腦內(nèi)D1、D2受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)、多巴胺放射自顯影分析、酪氨酸羥化酶免疫實(shí)驗(yàn)等研究證實(shí)，其多巴胺系統(tǒng)除缺少D3受體以外，與野生型C57BL/6J小鼠相比無明顯差異，因此是研究D3受體功能的理想動(dòng)物模型[4]。
以往研究表明多巴胺系統(tǒng)主要通過D2樣受體參與對(duì)痛覺的調(diào)制[58]。在大鼠輻射熱測(cè)痛模型上分別腹腔注射D1和D2樣受體特異性激動(dòng)劑和拮抗劑，發(fā)現(xiàn)只有D2樣受體的選擇性拮抗劑Spiperone有鎮(zhèn)痛作用,而其激動(dòng)劑和D1樣受體選擇性的激動(dòng)劑SKF38393以及拮抗劑SCH23390均對(duì)痛閾不產(chǎn)生顯著影響。靜脈注射D2樣受體拮抗劑氟哌啶醇(Haloperidol)也產(chǎn)生了鎮(zhèn)痛作用。類似的結(jié)果還有：皮下注射D2樣受體激動(dòng)劑溴麥角環(huán)肽(bromocriptine)對(duì)基礎(chǔ)痛閾無影響；皮下注射D1樣受體激動(dòng)劑SKF38393或D2樣受體特異性的激動(dòng)劑LY141865,發(fā)現(xiàn)前者對(duì)基礎(chǔ)痛閾無影響,而后者產(chǎn)生了痛敏；在小鼠測(cè)痛模型上腹腔注射SKF38393和溴麥角環(huán)肽對(duì)基礎(chǔ)痛閾也無影響。表明D2樣受體對(duì)痛閾有緊張性易化的作用[2]。最近Heikki Mansikka等[9]通過對(duì)D2受體基因敲除小鼠的研究發(fā)現(xiàn)D2RKO小鼠對(duì)輻射熱刺激的基礎(chǔ)痛閾有所上升但很輕微，即在內(nèi)源性多巴胺對(duì)痛覺的調(diào)制作用中，D2R參與其中，起到緊張性易化作用，但并不起主要作用。這進(jìn)一步提示，D3R或D4R在D2樣受體對(duì)痛閾的調(diào)制過程中起更大作用。
本研究結(jié)果顯示D3RKO小鼠對(duì)于輻射熱刺激的基礎(chǔ)痛閾明顯高于野生型的C57BL/6J小鼠，提示多巴胺D3受體在神經(jīng)系統(tǒng)參與痛覺的調(diào)制過程中起一定作用，主要引起基礎(chǔ)痛閾降低，亦即在正常小鼠D3R對(duì)基礎(chǔ)痛閾有緊張性易化作用。
中腦邊緣多巴胺系統(tǒng)(MLDS)途徑是獎(jiǎng)賞效應(yīng)過程中傳遞多巴胺的專一性通路，是公認(rèn)的與成癮有關(guān)的最重要的腦區(qū)。Xu等[4]對(duì)D3RKO小鼠的研究表明，D3RKO小鼠對(duì)可卡因的敏感性增強(qiáng)，對(duì)安非它明的條件性位置偏愛增高，提示D3R對(duì)機(jī)體的成癮過程也主要起抑制作用。同時(shí)，中腦邊緣多巴胺系統(tǒng)與脊髓SmVLOPAG脊髓組成的痛覺調(diào)制通路[10]有著密切的聯(lián)系，并且各種各樣的精神及軀體依賴性藥物如苯丙胺類、阿片類等，都具有一定的鎮(zhèn)痛及產(chǎn)生幻覺的作用，使人精神亢奮或飄飄欲仙，感覺舒爽，有些成癮性藥物如杜冷丁本身就是由于鎮(zhèn)痛作用而導(dǎo)致機(jī)體最終成癮，據(jù)此我們推測(cè)，多巴胺D3受體對(duì)痛覺的調(diào)制過程可能是影響機(jī)體成癮的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果顯示D3受體可以使小鼠痛覺敏感，即舒爽與疼痛、成癮與抑制成癮這兩對(duì)相互對(duì)抗作用都在D3受體的功能中得到體現(xiàn)，因此，對(duì)D3受體參與痛覺調(diào)制作用的研究可能會(huì)對(duì)進(jìn)一步研究DA系統(tǒng)在藥物成癮中的作用提供新的理論支持。
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