◆ 白血病及淋巴瘤研究
白血病是一種血液或骨髓的惡性疾?。ㄑ耗[瘤）。體細胞DNA發生突變會引起原癌基因的活化及抑癌基因的失活，從而使細胞的凋亡、分化或分裂等過程發生紊亂，最終導致白血病的發生。1960年，研究人員首次發現人類22號染色體在與9號染色體（也稱為“費城染色體”）發生易位之后會異?？s短，這是世界上第一次發現在任何惡性腫瘤中都能夠發生的染色體突變情況。近年來，隨著對影響細胞增殖的細胞因子及調控因子研究的不斷深入，人們發現那些編碼各種轉錄因子的基因很可能參與了對白血病的分子調控。由于miRNA能介導mRNA的剪切或抑制其所攜帶遺傳信息的轉錄，白血病研究領域的研究人員也開始關注miRNA與其靶信使RNA的這種相互作用，特別是那些與白血病病理過程相關的基因。以往通常采用Norther-blot和實時定量PCR（real-time PCR）等低通量的技術手段來研究miRNA的表達，現在新開發的芯片技術幾乎能夠在任何類型樣品中高通量獲得所有miRNA及其前體的表達譜。
miRNA研究回顧
1）Jia Yu等人在分析了Sanger miRNA registry（7.1版）中所有人類326個miRNA的成簇性后發現有148個可以歸屬到9組51個簇中。根據實驗模型得出的結果，該小組成員隨后在多種不同的造血細胞系中進行了Norther-blot實驗，他們的目的是想證明在造血過程及白血病發病過程中也存在所發現的那些miRNA簇。這項突破性的研究首次系統報道了人類造血細胞miRNA簇表達譜，讓人們首次認識到這些miRNA基因簇在不同生物過程中的功能和機制。
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2）George Calin和一個國際研究小組合作，他們利用miRNA表達譜研究了B細胞慢性淋巴性白血?。╟hronic lymphocytic leukemia, CLL）中miRNA的表達特點。George等人采用了分別對應245種人類及小鼠miRNA的特征性寡核苷酸探針來進行芯片實驗，進而發現了miRNA組表達模式在CLL與正常的CD5陽性B淋巴細胞中存在顯著的差異。實驗人員同時也用Northern-blot及實時定量逆轉錄PCR驗證了這些芯片結果。研究人員在對人類CLL進行miRNA微列陣分析后，發現有近200個miRNA表現出與CLL生物病理特征相關的表達特點，其中就包括一些與CLL預后相關的miRNA。
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3）為明確miRNA是否參與CLL的基因調控，Yuri Pekarsky與來自俄亥俄州立大學（Ohio State University）及加州大學圣迭戈分校（University of California, San Diego）的研究人員共同研究了原癌基因TCL1（T-cell leukemia/lymphoma 1）在B細胞性慢性淋巴細胞白血病中的表達（B-CLL chronic lymphocytic leukemia ，B-CLL）。3個小組的研究人員采用miRNA芯片技術檢測了326個人類及249個小鼠的miRNA基因后發現，miRNA在B-CLL中具有顯著的特征性表達模式。之后他們又繼續進行了Western-blot實驗以證明之前的預測，即Tcl1蛋白的過表達與惡性B-CLL的表型及染色體上11q區域的缺失相關。接下來研究人員使用一種miRNA靶標預測軟件RNAhybrid預測出TCL1最有可能是兩個miRNA的靶標，這兩個miRNA分別是miR-29b和miR-181b。Yuri Pekarsky等人最后用實時定量逆轉錄PCR及熒光素酶報告實驗證實，表達這兩個miRNA能抑制mRNA及蛋白水平Tcl1的表達。這些實驗結果提示Tcl1蛋白的表達至少在一定程度上受到miR-29b和miR-181b的調控。
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◆ 肺癌研究
肺癌通常指肺部組織的惡性轉化及增殖。肺癌是世界范圍內死亡率最高的一種腫瘤，估計每年有多達300萬人死于該病。根據腫瘤的大小以及顯微鏡下觀察到的癌細胞的組織形態，肺癌可以分為兩類：非小細胞（80%）和小細胞（約20%）肺癌。吸煙是人們罹患肺癌的原因之一，此外，有研究發現基因調控也是導致肺癌發生的一個重要因素。近期有研究表明至少有60種DNA突變（低外顯率等位基因）會略微提高罹患肺癌的幾率。由于肺癌的死亡率高于其它任何一種腫瘤，因此更需要對其發病機制作更深入的研究。盡管目前的分子生物學研究成果有助于我們了解肺癌的發生與發展，但那些暫時未發現的分子標記對于我們全面的了解肺癌的生物學特征仍舊起著至關重要的作用。miRNA就是眾多有待發現的生物標記之一，因為它通過表觀遺傳學機制進行基因表達調控，而以往都是利用Northern-blot和real-time PCR等低通量的技術手段研究miRNA的表達。得益于技術的進步，今天我們已經可以用芯片技術全面研究任何類型樣本中miRNA及其前體的表達譜。
miRNA研究回顧
1）Nozomu Yanaihara等人在肺癌的診斷與預后中研究了microRNA分子表達譜，結果顯示miRNA表達譜實際上是一項肺癌診斷與預后標記。該研究小組結合傳統的RT-PCR技術與先進的芯片技術發現并證實了miRNA表達特征，同時將miRNA的表達改變與腫瘤相關基因的下調相關聯。肺部腺癌的miRNA分子標記還與病人的生存相關，這其中包括那些與腫瘤遷移并不相關的miRNA。
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2）來自日本的Yoji Hayashita等人研究了21種miRNA在多種肺癌細胞系中的表達改變。之所以選擇這21個miRNA是因為經過miRNA靶標預測軟件TargetScan的預測，它們的靶基因都與腫瘤發展密切相關。該研究小組將Northern-blot及Southern-blot技術與real-time PCR技術相結合，在19種肺癌細胞系及2種永生化的肺表皮細胞系中得到了全面的miRNA表達譜。這項研究首次提供證據證明了肺癌患者染色體13q31.3區域C13orf25基因第三個內含子中的miRNA簇（miR-17-92）會經常發生過表達，這一現象在擁有小細胞肺癌病史的病人樣本中尤為明顯。研究人員進一步表明該miRNA簇對肺癌細胞的生長具有刺激活性，并且認為C13orf25基因很可能是miRNA簇miR-17-92的一個表達載體。
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3）來自耶魯大學（Yale University）的Steven Johnson等人與來自Ambion公司的科研人員一道，共同探究了lethal-7（let-7）microRNA家族究竟如何調控RAS這一與信號傳遞G蛋白相關基因。研究人員使用了芯片技術并結合Northern-blot實驗，發現let-7 miRNA家族在秀麗隱桿線蟲（C. elegans）的2個不同組織及兩個不同人類細胞系中都負調控RAS。他們在肺癌組織中發現miRNA let-7的表達與RAS蛋白的表達呈負相關，并且還在體外實驗中證明了let-7的過表達會抑制肺癌細胞系的的生長，這暗示二者之間很可能存在一個因果關系。該研究小組對于let-7在肺癌中的研究結果可以總結如下：let-7在肺癌中表達下調，肺癌患者的染色體經常會缺失許多包涵了let-7基因的區域，過表達let-7可以抑制肺癌細胞系的生長，原癌基因RAS的表達受到let-7的調控，最后是RAS在肺癌樣本中顯著過表達。以上這些結果顯著表明let-7是肺組織中的一個腫瘤抑制因子。
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◆ 腦瘤和神經系統腫瘤研究
腦瘤是由異常和失控的細胞分裂所致產生的一種顱內腫瘤。腦組織本身、顱神經、腦膜、頭骨、垂體和松果體等都是腦瘤經常發生的地方，當然，腦瘤還可能是由身體其它器官的腫瘤轉移而來。盡管腦瘤能夠影響腦部任何部分的功能，但原發性（也即真正的）腦瘤在兒童中位于后顱窩溝，而在成人中則位于腦半球的前三分之二。最常見的原發性惡性腦瘤是多形性膠質母細胞瘤（glioblastoma multiforme, GBM），該腫瘤具有很強的侵襲和轉移能力，盡管治療GBM的手術及化療方法都在不斷改進，但病人的預后還是非常差，所以國際上有許多研究團體都致力于該腫瘤的研究，以期有所斬獲。盡管已經有一些遺傳和分子損傷被證實與GBM的發生相關，但我們仍然需要獲取更多關于GBM發生與治療的重要信息。以往都是利用Northern-blot和real-time PCR等低通量的技術手段研究miRNA的表達。得益于技術的進步，今天我們已經可以用芯片技術全面研究任何類型樣本中miRNA及其前體的表達譜。
miRNA研究回顧
1）S.A. Ciafre等人分別采用基因芯片技術和Northern-blot技術在發病率最高的原發性腦瘤--多形性膠質母細胞瘤中鑒定和證實了245種miRNA的表達情況。在對膠質母細胞瘤組織及膠質母細胞瘤細胞系進行分析比較后，該研究小組鑒定出了一批在腫瘤中表達水平發生顯著改變的miRNA。
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2）雖然目前已證實的哺乳動物miRNA特異性靶標還很有限，但研究人員發現miRNA在多種器官的正常發育過程中都能夠影響細胞的增殖與分化。Chan等人研究了miR-21在多形性膠質母細胞瘤中的表達，結果發現miR-21對體外培養的多形性膠質母細胞瘤細胞的凋亡具有抑制作用。該研究小組不僅使用了芯片技術獲得miR-21的表達信息并用Northern-blot技術加以證實，他們還在細胞發生凋亡之后開展了細胞轉化實驗，以確證miR-21的抗凋亡效果。
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3）直至目前我們還無法通過原位雜交技術得到miRNA表達譜，原位雜交實驗僅局限于在新鮮組織中進行。Peter Nelson等人利用新開發的PAKE（RNA-primed、array-based、Klenow Enzyme）miRNA芯片技術平臺以及鎖定核酸原位雜交（Locked Nucleic Acid（LNA）-based in situ hybridization, LNA-ISH）技術對先前已制備好的石蠟包被的人類大腦及少突神經膠質瘤組織樣本進行了miRNA原位表達研究。他們將miRNA的表達研究從組織水平提升到亞細胞水平，使得以前不能利用的大量石蠟包被組織樣本成為miRNA原位表達研究的重要實驗材料。該項研究顯示了在正常人大腦及少突神經膠質瘤組織中所表達的特異miRNA。不僅如此，原位雜交技術還成功被應用于篩選PAKE獲得的數據以及進行特異miRNA的定位，這充分說明miRNA在人類組織標本中具有很好的穩定性。所以不難想象，在組織樣本中對miRNA進行原位研究將是未來miRNA研究的一個重要組成部分。
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◆ 乳腺癌研究
除了非黑素瘤皮膚癌之外，乳腺癌是婦女最常患的一種腫瘤，每8名婦女中就有1名存在罹患侵襲性乳腺癌的風險。除了侵襲性乳腺癌外，另外一種非侵襲性乳腺癌也能使大量女性同胞遭受病痛。估計2007年新增加的罹患該病的人數將超過62000。乳腺癌不僅是女性最常見的腫瘤，同時也是婦女的第二大腫瘤殺手（僅次于肺癌）。男性由于缺乏對于乳腺癌的免疫能力，故同樣很容易罹患此病。研究人員已經對乳腺癌相關基因作了深入研究，發現了幾個與該病密切相關的基因。研究結果表明，攜帶異常BRCA1或BRCA2基因的女性在70歲前患乳腺癌的幾率高達85%，此外，她們同時還是卵巢癌的高發人群。除這兩個基因之外，科研人員還發現了一些與乳腺癌相關的基因，例如腫瘤抑制基因p53，隱性基因ATM以及不久前證實的基因p65。除了鑒定與乳腺癌腫瘤發生相關的基因之外，科研人員還發現了一批能作為腫瘤抑制子或原癌基因的乳腺癌特異性miRNA。以往的研究通常采用Northern-blot和real-time PCR等低通量的技術手段研究miRNA的表達。得益于技術的進步，今天我們已經可以用芯片技術全面研究任何類型樣本中miRNA及其前體的表達譜。
miRNA研究回顧
1）來自美國南伊利諾斯大學醫學院（Southern Illinois University School of Medicine）的M-L Si等人利用TagMan real-time PCR技術在乳腺癌組織及與之相匹配的正常乳腺組織中進行了miRNA表達譜研究。與先前的報道一致，該小組發現與正常乳腺組織相比，miR-21在乳腺癌組織中大量過表達。研究人員隨后用anti-miR-21寡核苷酸片段轉染乳腺癌細胞MCF-7，結果發現anti-miR-21能通過誘導細胞凋亡及阻礙細胞增殖等方式在體外抑制腫瘤細胞的生長及在異植體小鼠模型中有效抑制腫瘤的生長。綜合所有結果得知，原癌基因miR-21能夠通過調控bcl-2等基因從而調節腫瘤的發生，因此，miR-21可能可以作為一個新的乳腺癌治療性靶點。
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2）美國德克薩斯大學（University of Texas）的Anwar Hossain等人研究發現在乳腺癌擴增因子1（amplified in breast cancer 1, AIB1）所編碼的mRNA中有大量與miRNA Mir-17-5p互補的區域，并且Mir-17-5p能夠通過抑制AIB1 mRNA的轉錄來調節乳腺癌細胞的增殖。體外細胞培養實驗表明Mir-17-5p通過轉錄抑制而下調AIB1的表達，而在乳腺癌細胞系中Mir-17-5p是低表達的，所以就不難理解為何乳腺癌細胞會表達大量AIB1。該研究小組采用傳統的Northern-blot及Western-blot，再輔以報告基因實驗、細胞增殖實驗和軟瓊脂集落實驗來證明Mir-17-5p在乳腺癌中所扮演的重要角色，同時他們也運用基因過表達和基因敲除的方法證明了Mir-17-5p對乳腺癌細胞錨定不依賴性生長的抑制作用。這些結果開始逐步揭示Mir-17-5p在乳腺癌細胞中發揮腫瘤抑制作用的機制。
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3）美國和意大利的學者開展了一項合作計劃旨在研究那些在人類乳腺癌中表達異常的miRNA。他們使用Northern-blot及芯片技術來證實他們所發現的每一個乳腺癌特異性miRNA。研究人員鑒定出了表達發生顯著失調的一批miRNA（mir-125b、mir-145、mir-21、以及mir-155），同時他們還發現了一些與乳腺癌某些病理特征，例如雌激素分泌、黃體酮受體表達、腫瘤分期、血管侵襲和癌細胞增殖相關的miRNA。該項研究成果加深了我們對于乳腺癌分子機制的認識，提示了一些miRNA的異常表達很可能在乳腺癌的發病機理中扮演極其重要的角色。
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◆ 前列腺癌和結腸癌研究
前列腺癌與結腸癌都屬于上皮細胞癌，即發生病變和惡性轉化的是包裹器官的上皮組織，而不是器官本身。目前美國男性患前列腺癌的人數已經超過肺癌而躍居第一位，同時前列腺癌患者的死亡率在各種腫瘤中也同樣高居第二位。在西方國家，結腸癌的患病人數雖位列第三，但其致死率卻排名第二。盡管對于前列腺癌和結腸癌等上皮細胞癌已經進行了相當多的研究，但我們對于這些腫瘤分子發生機制的了解還相當少。最近的一些前列腺癌研究結果表明染色體的重排會導致一些基因相互合并，形成研究人員所稱的融合基因。在大多數所研究的前列腺癌組織樣本中都觀察到這種具有獨特的分子特征的融合基因，但是在良性或者未發生惡性轉化的前列腺組織中則發現有基因融合現象。這些重要的研究發現說明在其它上皮細胞腫瘤中也可能會發生染色體的重排。miRNA在這類型腫瘤中的作用開始受到關注，研究人員想弄清楚miRNA在上皮細胞腫瘤中究竟起到何種作用。
miRNA研究回顧
1）來自舊金山海灣地區的Michael Mattie等人采用經過優化的高通量miRNA表達譜技術評估了前列腺癌和乳腺癌活組織樣本中的一些新的生物標記。傳統的高通量miRNA表達譜研究需要大量樣本，而臨床樣本通常只是少量手術切除的病變組織或者穿刺檢查剩下的一點組織，因此大大限制了高通量技術的運用。Michael Mattie等人所采用的高通量研究方法只需要極少量的樣本，因此克服了樣本量不足這個障礙。在該項研究中，研究人員采用了一種全新的研究方法，即將miRNA的標記與線性放大相結合，從而只需要幾皮克純化的miRNA就能獲得高敏感度的miRNA芯片表達譜。在兩個不同前列腺癌細胞系中分別用芯片技術和定量逆轉錄PCR檢測了miRNA的表達水平，二者的結果體現了很好的一致性（R2=0.81）；對乳腺癌和前列腺癌病人臨床活組織樣本的研究結果成功證明了樣本放大、標記和芯片研究這一技術平臺的有效性。該小組的研究成果表明采用經過優化的miRNA特異性芯片技術平臺就能從乳腺癌和前列腺癌的活組織切片這樣的小量臨床樣本中獲得能夠提供新的生物鑒定標記的miRNA表達譜。
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2）Yukihiro Akao等人在對miRNA let-7在人類結腸癌和細胞系中的表達作了一番研究后發現，不論是腫瘤組織還是細胞系中都有約三分之一出現let-7表達下調。該研究小組使用半定量逆轉錄PCR，同時結合使用細胞轉染及Western-blot實驗以研究let-7在結腸癌中究竟扮演何種角色。向低表達let-7的人類結腸癌細胞DLD-1中轉染let-7a-1前體（染色體 9q22.3）后，細胞生長受到抑制而且RAS及c-myc蛋白表達水平也出現下調，但是編碼這兩個蛋白的mRNA卻沒發生顯著變化。該實驗結果表明miRNAlet-7很可能參與了對結腸癌細胞生長的調節，而且還強調了miRNA對于開發新的抗腫瘤RNA藥物的重要性。
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3）Yaguang Xi等人利用細胞株HCT-116（p53野生型）和HCT-116（p53缺失型）在結腸癌中研究了腫瘤抑制子p53調節miRNA的表達以及已發生轉錄的信使RNA的機制。研究人員采用了miRNA芯片技術和實時定量逆轉錄PCR技術以研究p53對miRNA的表達影響。結果表明細胞內有近200個mRNA會受到轉錄后水平的調節。進一步的序列分析表明這些mRNA中有一些可能是miRNA的靶標，例如轉錄起始因子eIF-5A、eIF-4A以及蛋白磷酸酶1（Protein phosphatase 1）。Yaguang Xi等人所開展的這項開創性研究第一次證明了野生型p53與miRNA之間的相互作用會影響其它基因的表達，從而讓我們更深入地了解了p53如何通過不同機制在多個水平調節基因的表達。
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◆p53研究
由于腫瘤抑制基因p53在信號轉導途徑及細胞DNA修復中所起的重要作用，1993年著名的美國《科學》（Science）雜志將其評選為當年的“年度分子”（"Molecule of the Year"）。P53具有重要的生物學功能，它能通過多種機制行使一個抗腫瘤基因的作用。在細胞受到持續損傷時p53能夠激活DNA修復功能，阻斷細胞周期，在損傷過于嚴重以致不能修復時甚至會誘導細胞凋亡。有趣的是，在正常沒有受到損傷的細胞中，p53以一種失活形式存在，并與MDM2蛋白結合。一旦DNA發生損傷，MDM2就會發生磷酸化并與p53分離。隨著技術的進步，研究人員現在已能觀察p53在多種細胞損傷應答中所扮演的角色，特別是腫瘤細胞。目前認為miRNA參與了多個生物信號途徑的調節，其中就包括p53信號轉導途徑。
miRNA研究回顧
1）來自瑞典卡羅林斯卡研究所（Karolinska Institute，Sweden）的Cristina Méndez Vidal等人在小鼠中研究了p53介導的Wig-1蛋白表達，發現該蛋白能夠與具有siRNA和miRNA類似結構特點的雙鏈RNA結合。該小組研究人員采用細胞培養、轉化及免疫學技術在體外證實Wig-1能夠與siRNA/miRNA結合，從而提示Wig-1參與了miRNA對細胞生長和生存的調節，這同時也揭示了p53如何通過miRNA來誘導細胞生長阻滯和/或凋亡。研究人員認為，Wig-1與miRNA結合后能夠穩定miRNA與其靶mRNA形成的不完全配對雙鏈，從而影響靶mRNA的穩定性、轉錄甚至翻譯?；谝延械陌l現，研究人員構建了缺失雙鏈RNA結合能力的Wig-1突變體以進一步研究Wig-1的功能，這一研究結果將最終確定Wig-1與雙鏈RNA的結合在p53介導的腫瘤抑制中所起的作用。
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2）來自荷蘭、意大利及日本三地的科研人員合作構建了一個表達大多數人類miRNA克隆及所對應DNA片段的載體文庫以篩選具有新型功能的miRNA。經過篩選，研究人員發現miR-372和miR-373在細胞轉化過程中是原癌基因的幫兇，都能夠誘導含有原癌基因RAS和野生型p53基因的人類原代細胞發生增殖和癌變。這些miRNA能通過直接抑制腫瘤抑制蛋白LATS2的表達來中和p53介導的CDK表達抑制。該小組的研究結果表明miRNA很可能是人類睪丸精子細胞癌的潛在原癌基因，由于miRNA能夠阻斷p53信號通路，因此即使在有野生型p53存在的條件下細胞仍然可以發生惡性生長。
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3）Michael Dews等人對由Myc激活的miRNA簇所導致腫瘤血管生成增加的現象進行了研究，以確定原癌基因Myc在遺傳背景復雜的腫瘤中對新血管生成的影響。在體外，低度過表達激活的K-RAS或Myc基因就能導致p53缺失小鼠的結腸細胞發生惡性轉化，因此研究人員利用結腸細胞這一特性在體內和體外研究了RasGfp與RasGfpMyc對細胞生長的不同影響。為了確定Myc對腫瘤生長的作用，研究人員對不同大小的腫瘤進行了免疫組化分析，之后又采用芯片技術測定了Myc對促血管和抑血管生成分子表達的影響（芯片結果經過了實時定量逆轉錄PCR和免疫印跡的驗證）。研究人員繼續開展了蛋白表達和細胞生長研究以弄清miR-17-92在惡性生長且只表達RAS的細胞中發生表達上調所具有的生物學意義。研究結果表明，miR-17-92會影響一些非細胞自身的生理過程，例如腫瘤的血管生成。因此，針對miRNA的反義核苷酸片段正作為一項新的治療技術而越來越受到人們的重視，因為這種技術可能對那些已經具有抗凋亡能力的腫瘤細胞具有同樣的療效。
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