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“病從口入”這句古諺很好的描述了在人類與疾病的抗爭史上的一類常見病——腸道病原微生物引起的腸道疾病。相較于已經被控制的天花等病原，由此類病原體引起的病疫在21世紀的今天仍然給人類的生產和生活帶來著不小的損失。因此對它們的研究一直廣受關注。研究者們意識到，出血性大腸桿菌、沙門氏桿菌等腸道病原微生物，通過口腔進入消化道，在經過胃內極酸性環境時，需要啟動數個抗酸系統來維持其細胞內酸堿度，最終抵達腸道進行繁衍和致病。也就是說，抗酸系統是保證此類病原菌成功侵染人體的關鍵，如果抗酸系統不能有效工作，那么細菌將會被胃內的酸性環境殺死。因此，對腸道病原微生物的抗酸系統的研究，將有助于人們了解腸道微生物的侵染過程，也為潛在的治療方案和藥物設計提供研究基礎。 以出血性大腸桿菌O157:H7為例，目前已知至少存在四個獨立的抗酸系統，除了抗酸系統1之外，其他三個抗酸系統均是由胞質內的脫羧酶和細胞膜上的轉運蛋白組成，通過底物的化學反應和跨膜交換運輸，達到消耗細胞內部氫離子濃度，降低酸度的效果。 在這項工作中，施一公教授課題組通過大量系統的生化分析首次發現并證實了決定抗酸系統3的膜轉運蛋白AdiC的pH感受器，即其啟動 “開關”——蛋白上的第74位酪氨酸。研究者們通過分析AdiC蛋白的結構信息，結合體外的底物轉運實驗，在近一百個可能的位點上鑒定出了決定轉運工作開關的這一核心氨基酸。正常的AdiC在pH降到6.5以下才開始工作，在大于pH6.5的環境下關閉轉運活性;在將此氨基酸“移除”的突變體上，AdiC蛋白的轉運不再受到環境酸堿度的影響，在一定酸堿度范圍內處于始終有活性的狀態。 進一步，研究者揭示了第74位酪氨酸如何控制蛋白感受酸堿度變化并調節活性的分子機理，通過氨基酸殘基替換的比較研究，證實了這一過程是通過正電荷-π鍵相互作用來實現的，這種非常規氫鍵的鍵合作用是首次在蛋白感受外界環境酸堿度的過程中被發現。 此項工作由生命學院碩士研究生王盛，被CLS錄取、在施一公實驗室從事本科畢設的鄢仁鴻，醫學院CLS二年級學生張曦，和清華化生基科班三年級本科生初祺，在施一公教授的指導下完成。 作者簡介： 施一公教授的研究組近年來一直致力于病原微生物及癌細胞抗酸系統膜轉運蛋白的研究，發表了一系列高影響力的科學論文。在09年至12年，分別報道了從屬于抗酸系統3的膜轉運蛋白AdiC和從屬于抗酸系統2的膜轉運蛋白GadC的處于三種不同狀態的晶體結構【Gao et al, 2009, science; Gao et al, 2010, Nature; Ma et al, 2012, Nature】，并通過生化手段揭示了抗酸過程中底物跨膜運輸的分子機理，提出了一個由谷氨酰胺參與的全新抗酸系統模型【Lu et al, 2013, Cell Research; Ma et al, 2013, JBC】;在此研究的基礎上他們還開展了針對癌細胞抗酸機制的研究【Huang et al, 2013, Cell Research】。 原文摘要： Molecular mechanism of pH-dependent substrate transport by an arginine-agmatineantiporter Sheng Wang, Renhong Yan, Xi Zhang, Qi Chu, and Yigong Shi Enteropathogenic bacteria, exemplified by Escherichia coli, rely on acid-resistance systems (ARs) to survive the acidic environment of the stomach. AR3 consumes intracellular protons through decarboxylation of arginine (Arg) in the cytoplasm and exchange of the reaction product agmatine (Agm) with extracellular Arg. The latter process is mediated bythe Arg:Agm antiporter AdiC, which is activated in response to acidic pH and remains fully active at pH 6.0 and below. Despite our knowledge of structural information, the molecularmechanism by which AdiC senses acidic pH remains completely unknown. Relying on alanine-scanning mutagenesisand an in vitro proteoliposome-based transport assay, we have identified Tyr74 as a critical pH sensor in AdiC. The AdiC variant Y74A exhibited robust transport activity at all pH values examined while maintaining stringent substratespecificity for Arg:Agm. Replacement of Tyr74 by Phe, but notby any other amino acid, led to the maintenance of pH-dependent substrate transport. These observations, in conjunction with structural information, identify a working model for pH-induced activation of AdiC in which a closed conformation is disrupted by cation–π interactions between proton and the aromatic side chain of Tyr74. |
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