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一.ELISA標(biāo)準(zhǔn)操作要點(diǎn)
優(yōu)質(zhì)的試劑良好的儀器和正確的操作是保證ELISA檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠的必要條件ELISA中用的蒸餾水或去離子水包括用于洗滌的應(yīng)為新鮮的和高質(zhì)量的本公司要求使用的純化水電導(dǎo)率小于1.5μs/cm 1.標(biāo)本的采取和保存 大部分ELISA檢測(cè)均以血清為標(biāo)本血清標(biāo)本可按常規(guī)方法采集應(yīng)注意避免溶血紅細(xì)胞溶解時(shí)會(huì)釋放出具有過(guò)氧化物酶活性的物質(zhì)以HRP為標(biāo)記的ELISA測(cè)定中溶血標(biāo)本可能會(huì)增加非特異性顯色血清標(biāo)本宜在新鮮時(shí)檢測(cè)如有細(xì)菌污染菌體中可能含有內(nèi)源性HRP也會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性反應(yīng)一般說(shuō)來(lái)在5天內(nèi)測(cè)定的血清標(biāo)本可放置于4℃標(biāo)本在冰箱中保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致血清IgG聚合使間接法的試劑本底加深超過(guò)一周測(cè)定的需－20℃保存凍結(jié)血清融解后蛋白質(zhì)局部濃縮分布不均應(yīng)充分混勻并避免產(chǎn)生氣泡混濁或有沉淀的血清標(biāo)本應(yīng)先離心或過(guò)濾澄清后再檢測(cè)反復(fù)凍融會(huì)使抗體效價(jià)跌落所以測(cè)抗體的血清標(biāo)本如需保存作多次檢測(cè)宜少量分裝冰存保存血清自采集時(shí)就應(yīng)注意無(wú)菌操作也可加入適當(dāng)防腐劑. 抗凝不完全的標(biāo)本因纖維蛋白原的干擾而造成假陽(yáng)性建議盡量不用抗凝血尤其是肝素抗凝劑. 2.加樣 加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在ELISA板孔的底部避免加在孔壁上部并注意不可濺出. 3.保溫 在建立ELISA方法作反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究時(shí)實(shí)驗(yàn)表明兩次抗原抗體反應(yīng)一般在37℃經(jīng) 1-2小時(shí)產(chǎn)物的生成可達(dá)頂峰為避免蒸發(fā)板上應(yīng)加蓋也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔反應(yīng)板不宜疊放以保證各板的溫度都能迅速平衡應(yīng)注意溫育的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確由于公司的試劑盒溫育是在空氣浴中完成采用水浴會(huì)造成值偏高或花板另外溫育中還有邊緣效應(yīng)邊上的值會(huì)偏高建議為了客觀的判斷結(jié)果將質(zhì)控放在非邊緣位置. 4.洗滌 洗滌在ELISA過(guò)程中雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟但卻決定著實(shí)驗(yàn)的成敗ELSIA就是靠洗滌來(lái)達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的通過(guò)洗滌以清除殘留在板孔中沒(méi)能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)以及在反應(yīng)過(guò)程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)聚苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的而在洗滌時(shí)應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來(lái)可以說(shuō)在ELISA操作中洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)應(yīng)引起操作者的高度重視操作者應(yīng)嚴(yán)格按要求洗滌不得馬虎. 洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是疏水性的非離子型洗滌劑既含疏水基團(tuán)也含親水基團(tuán)其疏水基團(tuán)與蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)借疏水鍵結(jié)合從而削弱蛋白質(zhì)與固相載體的結(jié)合并借助于親水基團(tuán)和水分子的結(jié)合作用使蛋白質(zhì)回復(fù)到水溶液狀態(tài)從而脫離固相載體洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20其濃度可在0.05%-0.2%之間高于0.2%時(shí)可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗(yàn)的靈敏度 洗板時(shí)注意各種試劑盒的洗液不要混用如果洗液需要稀釋?xiě)?yīng)按要求稀釋所用的水電導(dǎo)率最好在1.5us/cm之下洗液如果結(jié)晶應(yīng)待其融解后配制保證洗板浸泡時(shí)間為40秒左右孔內(nèi)液體被洗板機(jī)吸收得越干凈洗滌效果更好手工洗板防止洗液在孔內(nèi)形成氣泡. 5.顯色和比色 TMB經(jīng)HRP作用后約40分鐘顯色達(dá)頂峰隨即逐漸減弱至2小時(shí)后即可完全消退至無(wú)色TMB的終止液有多種疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉（SDS）等酶抑制劑均可使反應(yīng)終止這類(lèi)終止劑尚能使藍(lán)色維持較長(zhǎng)時(shí)間（12-24小時(shí)）不褪是目視判斷的良好終止劑此外各類(lèi)酸性終止液則會(huì)使藍(lán)色轉(zhuǎn)變成黃色此時(shí)可用特定的波長(zhǎng)（450nm）測(cè)讀吸光值酶標(biāo)比色儀簡(jiǎn)稱(chēng)酶標(biāo)儀通常指專(zhuān)用于測(cè)讀ELISA結(jié)果吸光度的光度計(jì)酶標(biāo)儀的主要性能指標(biāo)有：測(cè)讀速度讀數(shù)的準(zhǔn)確性重復(fù)性精確度和可測(cè)范圍線(xiàn)性等等優(yōu)良的酶標(biāo)儀的讀數(shù)一般可精確到0.001準(zhǔn)確性為±1%重復(fù)性達(dá)0.5%酶標(biāo)儀不應(yīng)安置在陽(yáng)光或強(qiáng)光照射下操作時(shí)室溫宜在15~30℃使用前先預(yù)熱儀器15-30分鐘測(cè)讀結(jié)果更穩(wěn)定 測(cè)讀A值時(shí)要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰如OPD用492nm波長(zhǎng)有的酶標(biāo)儀可用雙波長(zhǎng)式測(cè)讀即每孔先后測(cè)讀兩次第一次在最適波長(zhǎng)（W1）第二次在不敏感波長(zhǎng)（W2）兩次測(cè)定間不 移動(dòng)ELISA板的位置最終測(cè)得的A值為兩者之差（W1-W2）雙波長(zhǎng)式測(cè)讀可減少由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾. 二.本底及假陽(yáng)性產(chǎn)生的原因分析
1.基因工程抗原與合成肽抗原的區(qū)別 1.1基因工程抗原是抗原基因在質(zhì)粒載體中原核或真核表達(dá)的蛋白質(zhì)抗原多以大腸桿菌或酵母菌為表達(dá)系統(tǒng)該類(lèi)抗原與合成肽相比具有以下特點(diǎn)： a.分子量大合成肽采用化學(xué)方法制備由于工藝的局限合成數(shù)量有限只能達(dá)到數(shù)百個(gè)氨基酸；而利用基因工程制備的抗原分子量更大 b.穩(wěn)定性好包被的抗原的穩(wěn)定性可使試劑盒的效期得到保證早期以合成肽為包被抗原的試劑盒效期只有3-4個(gè)月采用基因工程抗原后效期大大延長(zhǎng)了 c.基因工程抗原將特異性抗原決定簇基因融合表達(dá)表達(dá)產(chǎn)物包含更多的抗原決定簇可提高試劑盒的靈敏度提高檢出率 d.純化難度大基因工程抗原的純化技術(shù)難度較大 1.2合成多肽抗原是根據(jù)蛋白質(zhì)抗原分子的某一抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段合成肽抗原有以下特點(diǎn)： a.分子量太小 b.一般只含有一個(gè)抗原決定簇 c.純度高 d.穩(wěn)定性差 由于基因工程抗原較于合成肽抗原有無(wú)可比擬的優(yōu)越性ELISA診斷試劑經(jīng)歷了從合成肽向基因工程抗原的過(guò)渡就HCV ELISA試劑盒來(lái)講第一代產(chǎn)品為合成肽抗原主要是HCV特異性抗原決定簇的肽片段；第二代產(chǎn)品包被的抗原既有基因工程抗原又有合成肽只是當(dāng)時(shí)的基因工程抗原不全僅包括了HCV的核心區(qū)片段；第三代產(chǎn)品基本上采用了基因工程抗原而且這些抗原包括更多更穩(wěn)定純度更高的HCV特異性抗原第三代試劑的敏感度大大提高了 由于歷史的原因人們往往以反應(yīng)本底的好壞來(lái)衡量ELISA反應(yīng)試劑盒因此有些廠家為了保持較好的本底采用了單片段基因工程抗原及合成肽包被該類(lèi)試劑盒的流行病學(xué)敏感度不夠穩(wěn)定性也成問(wèn)題值得欣慰的是也有廠家堅(jiān)持試劑盒高的流行病學(xué)敏感度科學(xué)得對(duì)待反應(yīng)結(jié)果 2．假陽(yáng)性本底產(chǎn)生的原因 2. 1抗原因素 2.1. 1融合蛋白對(duì)基因工程抗原特異性的影響以丙肝診斷試劑盒為例為例因?yàn)榘坏幕蚬こ炭乖瓰槿诤系鞍装藖?lái)自表達(dá)載體的一些序列因此可以與血清中抗大腸桿菌的因子發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生了可疑標(biāo)本. 摘自《檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)在線(xiàn)》 |
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