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問題
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可能原因
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解決方法
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無顏色
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試劑孵育的時間沒有按說明書操作。
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確定生物素化抗體，聯接的hrp試劑或鏈霉親和素-hrp使用的時間是否適當。
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不同試劑盒或不同批號的試劑混用。
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重新檢查試劑的標簽，確保所有組分都屬于正使用的試劑盒。不能混用不同試劑盒或不同批號的試劑。
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漏加酶
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檢查操作流程，注意不要漏加
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hrp酶污染了疊氮鈉
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使用新配制的試劑，禁含疊氮鈉
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標準品有問題（若在標本孔中有信號）
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按說明書檢查標準品的配制過程
使用1瓶新標準品
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某一容器未洗凈,殘留滅活酶物質
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盡可能用試劑盒內容器,另覓一定要潔凈、可靠
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使用含血清的緩沖液配制/復溶抗體
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重新確認所選用的試劑
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.漏加顯色劑a或b
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加顯色劑后觀察孔中液面高度
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試劑配制/使用有誤
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將實驗重做；嚴格按說明書操作，每次配制和使用前看清標簽。
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緩沖液污染
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配制新鮮的緩沖液
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顯色弱
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超過有效期的產品可能會產生很弱的信號。
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檢查產品的有效期
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加入試劑的體積和時間有誤
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確定所使用的每一個試劑的體積正確和加入時間是適當。
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試劑、樣品用前未能平衡
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用前試劑、樣品置室溫平衡10分鐘左右
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縮短孵育時間能使實驗的信號變弱。
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檢查孵育的時間。
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在溫度變化的環境內孵育酶標板。
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確定孵育的溫度，應避免溫度的變化。
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使用了被污染的試劑
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檢查試劑是否被污染。
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標準品/標本制備方法不規范
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檢查標準品/標本的制備，標準品應按說明書進行復溶和稀釋。低溫貯存的標本避免反復凍融，嚴禁使用溶血標本。樣品用nan3防腐,抑制了酶的反應
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顯色底物制備不規范
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檢查底物的制備，如體積是否正確，混合是否恰當充分。
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檢測時間不當
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是否在規定的時間內檢測。
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儀器設定不正確，濾光片不匹配。
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儀器是否設定正確，濾光片的選擇是否相符等。
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高背景（本底）
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洗滌操作不規范
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洗板不充分，使用手工洗板常出現。最好使用洗板機，或使用洗瓶洗滌。每孔應完全充滿洗滌緩沖液，傾出時應迅速。若使用洗板機，應校準并設定足夠充滿每孔的體積量。板的內側不應接觸設備。
檢查每孔是否有殘留的洗液或每孔加樣量的體積是否準確。在兩次洗板之間加30秒的浸泡。
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實驗中孵育溫度和時間不適當
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確定每一實驗步驟的孵育溫度和時間是否適當
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酶加量過多
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加酶前驗看移液器調節量是否準確。
檢查稀釋度，必要時需做效價測定試驗。
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封閉不完全
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檢查封閉液的計算量；延長封閉時間。
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標本或標準品中的干擾物質
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做適當的對照
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顯色劑受光照時間較長,或污染
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顯色劑a和b應于使用前10分鐘從冰箱取出
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整批樣品放置時間過長,樣品污染
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樣品應保持新鮮,或低溫保存,防止污染
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緩沖液污染
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制備新鮮的緩沖液
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吸頭重復使用,未洗凈或消毒不完全而用于加酶或顯色劑
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吸頭盡可能一次性使用
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太多的信號：
全部的板子變成規則的藍色
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不充分的洗滌/洗滌步驟被遺漏-沒結合的過氧化物酶仍有殘留。
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最好使用洗板機充分洗滌
檢查孔內是否有殘留的洗液或加樣量是否準確。
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底物溶液混合太早并轉成藍色
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應控制底物混合的時機并立即使用
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太多的酶結合物
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檢查稀釋度，必要時進行效價測定
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封板膜或試劑容器被重復使用，導致hrp殘留，使tmb底物產生非特異藍色。
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使用新的封板膜，每步使用不同的試劑容器
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緩沖液中污染金屬或hrp
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制備新鮮緩沖液
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高cv值（cv：coefficient of variation），花板
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操作不慎或洗滌不充分
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按說明書洗板、加樣、顯色。洗板尤為重要，如上所述
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出現干板，沒有使用封板膜、封板膜重復使用
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確定每兩步驟間，酶標板應保持濕潤。
使用封板膜封口，注意每步使用新的封板膜。
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由于操作失誤或板子質量差（結合不均勻）造成包板不均勻。
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稀釋用的pbs中不要加其它蛋白
檢查包被和封閉液體積、時間和試劑加入的方法。
檢查所使用的酶標板，使用elisa板（不要使用組織培養板）
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移液器不準確，吸頭重復使用。
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檢查并校準移液器。每次取樣必須換吸頭?；仡櫂吮镜募尤氩襟E，確保每次加樣的準確性，保證吸取的液體按所設定的體積吸入和排出，連續加樣時注意檢查吸頭，確保所加液體的體積。
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樣品離心處理不全,反應孔內發生凝血或殘留細胞成分
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標本充分離心, 3000rpm 6分鐘以上，嚴禁使用凝血（溶血）的標本
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緩沖液污染
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制備新鮮的緩沖液
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標準曲線可得到，但兩點之間區別很差（低或平的曲線）
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酶結合物不足
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檢查稀釋度，必要時進行效價測定
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捕獲抗體沒有很好結合到板上
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檢查所使用的酶標板，使用elisa板（不要使用組織培養板）
稀釋用的pbs中不要加其它蛋白
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檢測抗體不足
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檢查稀釋度，必要時進行效價測定
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板子顯色不足
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延長底物孵育實驗
使用推薦品牌的底物溶液
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操作不慎
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回顧elisa操作流程，消除任何擅自修改的程序。
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標準曲線稀釋度計算有誤
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核查計算的情況，制備新的標準曲線
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標準曲線很好，但是沒有任何期望的陽性信號產生
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在標本中無相應的細胞因子
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使用內參對照
重復實驗，重新考慮實驗的相應參數
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標本基質遮蓋檢測
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將標本至少做1∶2相應的稀釋，或進行系列稀釋觀測它的恢復性
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標準曲線很好，但是標本的判讀值很高
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標本中含的細胞因子水平超過檢測范圍
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將標本做稀釋并再次實驗
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當使用hrp酶結合物時，tmb底物加終止液后顯綠色
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孔中的試劑顯色不充分
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輕輕振蕩板子
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邊緣效應
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工作環境溫度不均衡
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避免將酶標板在變化溫度環境中孵育
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漂移
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實驗過程中出現間斷
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整個實驗應連續操作：在實驗開始前將所有標準品和標本做適當的準備
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試劑沒有按說明書平衡至室溫
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在所有試劑加入孔前，確保它們已平衡至室溫，除非說明書中有另外的要求。
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是否可更改試劑盒 所提供的實驗操
作步驟？
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一般廠商為確保最高的靈敏度和特異性，對試劑盒都進行了優化，為確保每一試劑盒實驗的規范性應按說明書操作。
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是否可混用不同試劑盒中的試劑？
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不允許。絕大多數試劑在每批試劑盒中是特異的，若有問題可與廠家或代理商聯系。
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是否可增加或減少標本的體積。
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商品化的試劑盒所需加入的標本體積是優化的，應按說明書操作，不建議更改所加標本的體積。
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是否可重確定自己的標準曲線的點？
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可以。說明書上有建議的制備標準曲線時標準品的稀釋度，可改變稀釋倍數和增加曲線的點，但是必須在檢測范圍內，高于試劑盒中最高標準品的點和低于靈敏度以下的點是無效的。
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