現(xiàn)貨促銷：無(wú)血清造血細(xì)胞培養(yǎng)基
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1 問(wèn)：請(qǐng)問(wèn)對(duì)同樣培養(yǎng)的相同濃度的細(xì)胞，用ELISA檢測(cè)其上清液相同細(xì)胞因子的濃度，不同的報(bào)道差別為什么很大？
參考解析：不同廠家的試劑盒當(dāng)然有很大影響。ELISA非常敏感，即使是同一個(gè)試劑盒，用同一個(gè)廠家同一濃度的刺激因子，incubate 時(shí)間不同也會(huì)影響結(jié)果，這就是為什么每次都要設(shè)內(nèi)部和外部對(duì)照的原因。這主要和其抗體標(biāo)準(zhǔn)品原料來(lái)源有關(guān)，建議購(gòu)買ELISA試劑盒時(shí)選擇大公司提供的產(chǎn)品，這樣結(jié)果比較可靠一點(diǎn)。
2 問(wèn)：ELISA屬固相免疫測(cè)定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。為什么ELISA反應(yīng)總是需要一定時(shí)間的溫育？
參考解析：溫育常采用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃（冰箱溫度）等。37℃是實(shí)驗(yàn)室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度
3 問(wèn)：檢測(cè)疫苗免疫小鼠后的抗體情況。用了商品化的試劑盒。
1 商品化的板子已經(jīng)用病毒裂解液包被了。
2 洗3次后，將陽(yáng)性和陰性血清（豬），樣品血清（小鼠）1：40稀釋加入，留2個(gè)空做空白對(duì)照，30分鐘37度
3 洗3次，在一個(gè)空白空中加入山羊抗小鼠二抗（1:1000），一個(gè)加入商品化已稀釋抗豬二抗（不知稀釋倍數(shù)）。在陽(yáng)和陰中加入抗豬二抗，樣品中加入抗鼠二抗。
4 洗4次。經(jīng)加入底物AB侯顯色15分鐘。終止。測(cè)630nm
結(jié)果加入豬二抗的空白空為0.277；陽(yáng)性為0.964，陰性為0.503%
假如鼠二抗的空白空為0.951：個(gè)樣品都在1.000作用
請(qǐng)問(wèn)為什么兩個(gè)空白空的值差那么多？是不是鼠二抗與包被的病毒抗原結(jié)合，還是二抗的稀釋倍數(shù)不夠？或者其他原因？
參考解析：
1首先抗豬二抗和抗鼠二抗本來(lái)就是不同的東西（且稀釋度不同），在沒(méi)有非特異性結(jié)合出現(xiàn)的情況下，應(yīng)該是OD值相差無(wú)幾，但是從現(xiàn)在的結(jié)果看，肯定是二抗有非特異性的結(jié)合（這一點(diǎn)從加入的樣品鼠血清孔 與 鼠二抗空白孔差別不大也可以看出來(lái)），故造成兩孔OD值差異。
2 當(dāng)然這么高的本底也有可能是你的抗體濃度使用稀釋度不當(dāng)或者洗板不徹底（殘余大量未結(jié)合的酶標(biāo)抗體）造成的，請(qǐng)首先查明。
3 不知道你使用的是什么底物進(jìn)行顯色，好像常規(guī)ELISA實(shí)驗(yàn)的底物是沒(méi)有檢測(cè)波長(zhǎng)在630nm的。
4 排除了2.3兩點(diǎn)的問(wèn)題再考慮是否是二抗不純并與包被的病毒裂解物結(jié)合的問(wèn)題。
你加入的商品化稀釋的抗豬二抗，卻不知道稀釋度，這在ELISA實(shí)驗(yàn)中是不可取的，酶標(biāo)抗體的濃度過(guò)高必然引起顯色本底很高。 你可以取包被的板條不加樣品直接加入梯度稀釋的酶標(biāo)記二抗，取OD值在0.1以下時(shí)的稀釋度再進(jìn)行檢測(cè)。若檢測(cè)值很低則是抗體的敏感性問(wèn)題，應(yīng)當(dāng)更換其它抗體。
4問(wèn)：請(qǐng)教一下，用雙夾心ELISA法檢測(cè)，用菌體免疫的小鼠和家兔，免疫后采集血清，可以直接包被血清嗎，還是需要純化后在包被？ 菌體與佐劑乳化時(shí)需要無(wú)菌操作嗎？裝血清用無(wú)菌操作嗎？
參考解析：血清不可以直接包被，主要是因?yàn)檠宓膒H和離子強(qiáng)度與通用的包被液不同，而且會(huì)造成一些非特異蛋白質(zhì)的吸附，不利于特異性抗原或抗體的檢測(cè)。
純化血清的方法很多，一般有鹽析法和柱層析法，也可二者聯(lián)合使用，視對(duì)純度要求不同而異。一般鹽析法（比如硫酸銨沉淀）純化后就可獲得主要的免疫球蛋白，而去除其他雜蛋白（如白蛋白等），如果需要進(jìn)一步純化的話，還可用凝膠層析法或離子交換層析法來(lái)進(jìn)一步純化獲得IgG，如果抗原足夠純的話，也可以用親和層析法來(lái)做，但這些實(shí)驗(yàn)會(huì)導(dǎo)致抗體效價(jià)的下降和免疫球蛋白的損失，所以要充分衡量利弊再做決定
5問(wèn)：要在balb/c小鼠上，免疫蛋白，做個(gè)預(yù)實(shí)驗(yàn)，elispot檢測(cè)CTL，elisa檢測(cè)抗體，我想不加強(qiáng)免疫，在第一次免疫一周后，就做能出結(jié)果嗎？
參考解析：加強(qiáng)免疫只是增加血液中抗體滴度，只是量的增加，理論上不影響定性檢測(cè)。elisa的敏感性很高，第一次免疫后，CTL和抗體都應(yīng)該能夠檢測(cè)到，但實(shí)際操作對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響很大，具體檢測(cè)效果如何，你應(yīng)該試著做做。
本底及假陽(yáng)性產(chǎn)生的原因分析
1. 基因工程抗原與合成肽抗原的區(qū)別
基因工程抗原是抗原基因在質(zhì)粒載體中原核或真核表達(dá)的蛋白質(zhì)抗原，多以大腸桿菌或酵母菌為表達(dá)系統(tǒng)。該類抗原與合成肽相比具有以下特點(diǎn)：
a.分子量大。合成肽采用化學(xué)方法制備，由于工藝的局限，合成數(shù)量有限，只能達(dá)到數(shù)百個(gè)氨基酸；而利用基因工程制備的抗原，分子量更大。
引起ELISA測(cè)定錯(cuò)誤結(jié)果的原因主要有：
1．標(biāo)本因素；
2．試劑因素；
3．操作因素。
本文就標(biāo)本因素對(duì)ELISA測(cè)定的影響做如下討論。
血清是最常用的ELISA標(biāo)本，血漿一般可視為與血清同等的標(biāo)本，標(biāo)本引起的假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果主要是干擾性物質(zhì)所致，分為內(nèi)源 性物質(zhì)和外源性物質(zhì)兩種：
1．內(nèi)源性物質(zhì)
有人認(rèn)為大約40%的人血清標(biāo)本中含有非特異性干擾物質(zhì)，可以不同程度影響檢測(cè)結(jié)果。
常見(jiàn)的干擾物質(zhì)有：類風(fēng)濕因子、補(bǔ)體、嗜異 性抗體、嗜靶抗原自身抗體、醫(yī)源性誘導(dǎo)的抗鼠Ig (s)抗體、交叉反應(yīng)物質(zhì)和其它物質(zhì)等。
（1）類風(fēng)濕因子
人血清中IgM、IgG型類風(fēng)濕因子（RF）可以與ELISA系統(tǒng)中的捕獲抗體及酶標(biāo)記二抗的FC段直接結(jié)合，從而導(dǎo)致假陽(yáng)性。 解決該情況的辦法是：①用F(ab)2替代完整的IgG；②標(biāo)本用聯(lián)有熱變性（63℃，10 min）IgG的固相吸附劑處理（將熱變性IgG加入到標(biāo)本稀釋液中同樣有效）；③檢測(cè)抗原時(shí)，可以用2-巰基乙醇等加入到標(biāo)本 稀釋液中，使RF降解。
（2）補(bǔ)體
ELISA系統(tǒng)中固相一抗和標(biāo)記二抗過(guò)程中，抗體分子發(fā)生變構(gòu)，其FC段的補(bǔ)體C1q分子結(jié)合位點(diǎn)被暴露出來(lái)，使C1q 可以將二者連接起來(lái)，從而造成假陽(yáng)性。解決的辦法是：①用EDTA稀釋標(biāo)本；②用53℃，10 min或56℃，30 min加熱血清使C1q滅活。
（3）嗜異性抗體
人類血清中含有能與嚙齒類動(dòng)物（如鼠等）Ig (s) 結(jié)合的天然嗜異性抗體，可將ELISA系統(tǒng)中一抗和二抗連接起來(lái)，也能造成假陽(yáng)性。解決的辦法是：可在標(biāo)本稀釋液中加入過(guò)量的動(dòng) 物Ig (s) ，但加入量不足或亞類不同時(shí)無(wú)效。
（4）嗜靶抗原的自身抗體
抗甲狀腺球蛋白、抗胰島素等嗜靶抗原的自身抗體，有時(shí)能與靶抗原結(jié)合形成復(fù)合物，在ELISA方法中均可干擾抗原抗體測(cè)定結(jié)果。 為避免以上情況出現(xiàn)，解決的辦法是：測(cè)定前需用理化方法將其解離后再測(cè)定。
（5）醫(yī)源性誘導(dǎo)的抗鼠Ig (s) 抗體
臨床開展的用鼠源性CD3等單克隆抗體治療，用放射性同位素標(biāo)記鼠源性抗體的影像診斷及靶向治療等新技術(shù)，均有可能使這些病人體 內(nèi)產(chǎn)生抗鼠抗體；另外，被鼠等嚙齒類動(dòng)物咬傷的病人體內(nèi)也可以產(chǎn)生抗鼠Ig (s) 抗體。這些病人ELISA測(cè)定時(shí)均可產(chǎn)生假陽(yáng)性。解決的辦法是：測(cè)定抗原時(shí)，在標(biāo)本中加入足量的正常鼠Ig (s) ，從而克服由于上述原因造成的假陽(yáng)性。
（6）交叉反應(yīng)物質(zhì)
類地高辛、類AFP樣物質(zhì)等，是與靶抗原有交叉反應(yīng)的物質(zhì)。在用多抗測(cè)定抗原時(shí)對(duì)測(cè)定結(jié)果影響不大，但在用單克隆抗體測(cè)定抗原時(shí) ，如果交叉抗原決定簇正好是所用單克隆抗體相對(duì)應(yīng)的靶決定簇時(shí)，也會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。
（7）標(biāo)本中其它成分的影響
血清脂質(zhì)過(guò)高、膽紅素、血紅蛋白及血液粘度過(guò)大等，均對(duì)ELISA測(cè)定結(jié)果有干擾作用。
2．外源性物質(zhì)
外源性物質(zhì)常常是由于用于ELISA測(cè)定的血標(biāo)本的采集、貯存等不當(dāng)所致。如標(biāo)本溶血、標(biāo)本被細(xì)菌污染、標(biāo)本貯存過(guò)久、標(biāo)本凝集 不全和采血管中添加物等影響。
（1）標(biāo)本溶血
由于各種人為原因引起的標(biāo)本溶血，均可因紅細(xì)胞破壞溶解時(shí)釋放出大量具有過(guò)氧化物酶活性的血紅蛋白，在以辣根過(guò)氧化物酶為標(biāo)記的 ELISA測(cè)定中，會(huì)導(dǎo)致非特異性顯色，干擾測(cè)定結(jié)果。為克服上述干擾作用，標(biāo)本采集時(shí)必須注意避免溶血。
（2）標(biāo)本受細(xì)菌污染
因菌體中可能含有內(nèi)源性辣根過(guò)氧化物酶，因此，被細(xì)菌污染的標(biāo)本同溶血標(biāo)本一樣，亦可產(chǎn)生非特異性顯色而干擾測(cè)定結(jié)果。
（3）標(biāo)本保存不當(dāng)
在冰箱中保存過(guò)久的標(biāo)本，血清中IgG可聚合成多聚體、AFP可形成二聚體，在間接法ELISA測(cè)定中會(huì)導(dǎo)致本底過(guò)深、甚至造成 假陽(yáng)性；標(biāo)本放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)（如一天以上），有時(shí)抗原或抗體免疫活性減弱，亦可出現(xiàn)假陰性。為克服上述干擾，ELISA測(cè)定的血清 標(biāo)本宜為新鮮采集；如不能立即測(cè)定，5天內(nèi)測(cè)定的血清標(biāo)本可存放于4℃，1周后測(cè)定的血清標(biāo)本應(yīng)低溫凍存；凍存后融解的標(biāo)本，蛋 白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應(yīng)充分混合后再測(cè)定，但混勻時(shí)應(yīng)輕柔，不可強(qiáng)烈振蕩。
（4）標(biāo)本凝集不全
在沒(méi)有促凝劑和抗凝劑存在的情況下，正常血液采集后1/2~2h開始凝固，18~24h完全凝固。臨床檢驗(yàn)工作中，有時(shí)為了爭(zhēng)取 時(shí)間快速檢測(cè)，常在血液還未開始凝固時(shí)即強(qiáng)行離心分離血清，此時(shí)的血清中仍殘留部分纖維蛋白原，在ELISA測(cè)定過(guò)程中可以形成 肉眼可見(jiàn)的纖維蛋白塊，易造成假陽(yáng)性結(jié)果；這類情況于次日復(fù)查時(shí)因血凝已完全，血清中不再有纖維蛋白原存在，故復(fù)查結(jié)果變?yōu)殛幮?。為避免上述干擾作用，解決的辦法最好是血液標(biāo)本采集后必須使其充分凝固后再分離血清，或標(biāo)本采集時(shí)用帶分離膠的采血管或于采血 管中加入適當(dāng)?shù)拇倌齽?nbsp;
（5）標(biāo)本管中添加物質(zhì)的影響
抗凝劑（如肝素，EDTA）、酶抑制劑（如NaN3可抑制ELISA系統(tǒng)中辣根過(guò)氧化物酶活性）及快速分離血清的分離膠等均對(duì)E LISA測(cè)定有一定干擾作用。 綜上所述，對(duì)臨床檢驗(yàn)ELISA測(cè)定中出現(xiàn)的假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果，在考慮試劑因素和操作因素之外，更多的應(yīng)從標(biāo)本因素方面進(jìn)行分析，并應(yīng)采取相應(yīng)措施排除干擾作用，從而為臨床提供正確可靠的檢測(cè)結(jié)果。