0 引言
我國是世界第二大農(nóng)藥生產(chǎn)國，同時也是第一大農(nóng)藥消費國。隨著各種農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及日常生活的廣泛應用，有關農(nóng)藥殘留引起環(huán)境污染的事件日益增多，因此農(nóng)藥污染問題成為急需監(jiān)測、治理的焦點之一。既往農(nóng)藥的檢測多采用氣相色譜法、液相色譜法等，這些方法需要昂貴的儀器設備、訓練有素的專業(yè)技術人員，消耗試劑多，檢測成本高，而且檢測時間長，不利于現(xiàn)場監(jiān)測 [1-3]。農(nóng)藥的免疫檢測技術因具有快速、靈敏、特異性高等優(yōu)點而引起相關研究人員和科研機構(gòu)的重視，成為農(nóng)藥檢測中一種簡便、樣品通量大、檢測費用低廉、適用現(xiàn)場監(jiān)測的分析方法 [4, 5]。毒死蜱(chlorpyrifos)，化學名稱為O,O-二乙基-O-(3,5,6-三氯-2-吡啶基)硫逐磷酸酯，作為我國“十一五”期間國家推廣使用的農(nóng)藥之一，它是一種高效、廣譜、中等毒性的有機磷類殺蟲劑，具有觸殺、胃毒和熏蒸三種作用方式，是防治糧食、蔬菜和其他經(jīng)濟作物的理想殺蟲劑，但它同時也對農(nóng)田環(huán)境及其有益生物產(chǎn)生了影響[6]，新近的流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn)毒死蜱與肺癌的發(fā)生可能存在某些聯(lián)系，而且有研究顯示其極可能具有內(nèi)分泌干擾作用[7]。隨著國內(nèi)甲胺磷、久效磷、甲基對硫磷、對硫磷等高毒有機磷農(nóng)藥的禁用，毒死蜱逐漸代替高毒農(nóng)藥，應用范圍越來越廣[8]，其污染檢測問題也隨之而來。制備毒死蜱單克隆抗體，建立毒死蜱的免疫檢測方法，可以有效地對毒死蜱殘留進行監(jiān)控分析，減少毒死蜱中毒事件的發(fā)生。本研究合成毒死蜱人工抗原，制備毒死蜱單克隆抗體，初步建立了毒死蜱間接ELISA 檢測方法。
1 材料
1.1 試驗動物與細胞
BALB/C 小鼠，6-8 周齡，雌性（購自揚州大學實驗動物中心）；小鼠骨髓瘤細胞系SP2/0（東南大學遺傳學研究中心提供）。
1.2 主要試劑
弗氏完全佐劑(Sigma 公司)、弗氏不完全佐劑(Sigma 公司)、辣根過氧化物酶-羊抗小鼠IgG(HRP-IgG，南京生興生物技術公司)、RPMI-1640 基礎培養(yǎng)基(Gibco 公司)、小牛血清(fetalcalf serum，F(xiàn)CS，杭州四季青公司)、20%小牛血清RPMI-1640 培養(yǎng)基、氨基喋呤(A)貯存液、次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷(HT)貯存液、HAT 培養(yǎng)基、HT 培養(yǎng)基、青、鏈霉素溶液、50％聚乙二醇(PEG)溶液、PBS 緩沖液、包被液、洗滌液及稀釋液(PBS-T 溶液，pH7.4)、封閉液、底物溶液(TMB)、毒死蜱樣品溶液、正辛酸(分析純，上海化學試劑公司)、25-28%濃氨水(分析純，上海化學試劑公司)、殺螟硫磷、對硫磷、馬拉硫磷標準品(江蘇省疾病預防控制中心惠贈)、60mmoL/L 乙酸緩沖液、20mmoL/LPBS 緩沖液、飽和硫酸銨溶液、毒死蜱溶液。
1.3 主要儀器
Ultraspec-4000 型紫外/可見分光光度儀(Pharmacia Biotech 公司)、HJ-3 型電磁攪拌器(常州國華電器有限公司)、低溫離心機(HITACHISCR20BC)、DOA-P181-BN 型抽氣泵(GelmanLaboratory)、SK-1 型快速混勻器(常州國華電器有限公司)、TGL-16 型高速臺式離心機(上海醫(yī)用分析儀器廠)、LD5-2A 型低速離心機(北京醫(yī)用離心機廠)、SW-CJ-2F 型凈化工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司)、IX51 型倒置顯微鏡(Olympus 公司)、5400 型CO2 培養(yǎng)箱(NAPCO公司)。
2 方法
2.1 毒死蜱完全抗原的合成與鑒定
2.1.1 半抗原合成
稱取 1.06 克3-巰基丙酸(10mmol)于三口平底燒瓶，用50ml 無水乙醇溶解，加入NaOH1.0143 克，在磁力攪拌器上加熱攪拌反應，直至溶解[9]。再加入溶于50ml 無水乙醇的毒死蜱原藥3.51 克(10mmol)，60℃下回流反應2h，過濾反應混合物，減壓濃縮。然后用5%NaHCO3 溶液50ml 將殘留物轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，正已烷(50ml×2)萃取2 次，棄去有機相。
然后用濃鹽酸調(diào)水相pH 至3 左右，二氯甲烷(50ml×3)萃取3 次，有機相過無水Na2SO4，減壓濃縮近干，得棕紅色油狀物，柱層析過硅膠柱，收集洗脫液(正己烷/乙酸乙酯,1：2)的流動相，減壓濃縮近干。加入少量無水乙醇溶解產(chǎn)物，重結(jié)晶后得到淺黃色晶體。合成路線見。
2.1.2 人工抗原的合成
將 0.0843 克(半抗原200μmol)溶于2mlN,N-二甲基甲酰胺中，然后加入等當量的二環(huán)已基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺，室溫下磁力攪拌反應過夜，離心收集上清液后，取500μl上清液加入6ml0.2M 硼酸鹽緩沖液(pH9.0)溶解的10mg/mlBSA 溶液中，常溫磁力攪拌下反應4h；另取500μl 上清液加入到7ml0.2M 硼酸鹽緩沖液(pH9.0)溶解的15mg/mlOVA 溶液中，常溫磁力攪拌下反應2h[6, 9]。前者合成物為免疫抗原，后者為包被抗原。
2.1.3 純化與鑒定合成抗原
凝膠過濾層析法純化免疫抗原和包被抗原，冷凍干燥，-20℃保存。紫外吸收光譜法鑒定合成抗原，鉬蘭比色法測定毒死蜱人工抗原結(jié)合比。
2.2 毒死蜱單克隆抗體的制備
2.2.1 小鼠免疫
將免疫抗原用PBS 緩沖液配制成1μg/μL 的溶液備用。取健康6-8 周齡雌性BALB/C 小鼠6 只，編號后按常規(guī)免疫方案分批免疫。第一次免疫，將免疫抗原PBS 溶液與等體積的弗氏完全佐劑充分混合，抽取混勻的乳液進行腹腔多點注射，每只鼠的注射量為200μL；兩周后進行第二次免疫，注射方法、注射體積不變，但改用弗氏不完全佐劑；以后按照第二次免疫方案以一周為間隔進行免疫；第三次免疫一周后，從小鼠尾部取少量血，通過間接ELISA法檢測小鼠血清抗體效價；待效價至少達到1∶1000 后，于融合前三天取同量免疫抗原不加佐劑對小鼠進行尾靜脈注射以強化免疫[10, 11]。
2.2.2 細胞融合
細胞融合當天從小鼠尾靜脈采血測定抗血清效價，選擇血清抗體呈陽性且效價較高者用于細胞融合。取免疫小鼠脾細胞與SP2/0 小鼠骨髓瘤細胞在50%聚乙二醇（PEG）作用下進行融合。融合方案為約1min 加完50%PEG，前30 秒逐滴加入，后30 秒可稍快，吹打1min，靜置1.5min，然后逐滴加入RPMI-1640 培養(yǎng)基，約6min 完成，再緩慢加入10mLRPMI-1640培養(yǎng)基以終止PEG 作用，750g 離心5min，棄上清夜，將細胞輕輕懸于20mLRPMI-1640 培養(yǎng)基中，置于CO2 培養(yǎng)箱待用。用RPMI-1640 培養(yǎng)基將飼養(yǎng)細胞配成2×105 個/mL 的懸浮液，將飼養(yǎng)細胞與融合細胞1∶1 混合，并轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)12-24h。最后750g 離心5min收集細胞，用50mLHAT 培養(yǎng)基懸浮細胞，分裝96 孔細胞培養(yǎng)板，每孔加入0.2mL，置于37℃、5%CO2 飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
2.2.3 陽性雜交瘤細胞篩選及克隆化
融合后每 3-4 天半量換液一次。2-3 天，骨髓瘤細胞明顯退化，5-7 后天待骨髓瘤細胞全部死亡，用HT 培養(yǎng)基取代HAT 培養(yǎng)基，每3-4 天半量換液一次。約6-7 天出現(xiàn)雜交瘤細胞克隆，細胞大、圓且透亮，在培養(yǎng)板的蓋板上畫上克隆生長的標記，記錄有雜交瘤細胞生長的孔數(shù)。采用間接ELISA 與競爭ELISA 聯(lián)合應用的方法對雜交瘤進行篩選，先用間接ELISA對所有雜交瘤生長孔的抗體進行初篩，再對陽性孔用競爭ELISA 進行抑制實驗，對特異性抗體陽性孔的雜交瘤細胞以有限稀釋法進行克隆和亞克隆，直至單克隆的雜交瘤克隆化后上清的陽性率是100%，以獲得穩(wěn)定的單克隆雜交瘤細胞株。擴大培養(yǎng)篩選出的單克隆雜交瘤細胞株，使用BALB/C 小鼠體內(nèi)誘生腹水的方法大量制備單克隆抗體。采用正辛酸-硫酸銨沉淀法(CAASP)純化抗體，從純化后得到的單克隆抗體溶液中吸取80μL，用PBS 緩沖液稀釋至2mL，隨后用紫外分光光度計分別測定稀釋液在260nm 及280nm 處的吸光度，計算抗體含量。
2.3 間接競爭ELISA 方法的建立
2.3.1 抗原抗體濃度的選擇
通過方陣法確定抗原抗體工作濃度，分別用0.1μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL、4.0μg/mL、8.0μg/mL 濃度的包被抗原分組包被酶標板，每孔100μL，4℃冰箱包被過夜。封閉后，將純化后的單克隆抗體用PBS-T 液分別稀釋至0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.4μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL，每孔50μL 分組對應加入封閉后的酶標板，隨后每孔加入50μLPBS-T液，37℃溫箱中溫育1h。另設兩孔陰性血清(1∶100 倍稀釋)和空白對照(PBS-T)。甩干酶標板，洗滌液PBS-T 洗滌3 次，每次5min， 吸水紙拍干。加入PBS-T 溶液1∶5000 倍稀釋的辣根過氧化物酶-羊抗小鼠IgG，每孔100μL，37℃溫箱中孵育1h。洗板后，每孔加入臨用前鮮配的底物(TMB)溶液100μL，避光置37℃溫箱15min，每孔加50μL2mol/L 的H2SO4終止反應。酶標儀上測定450nm 波長處的各孔吸光值。
2.3.2 標準曲線的建立
用選定的工作濃度的包被抗原包被酶標板，每孔100μL，4℃包被過夜。待封閉酶標板后每孔加入50μL 抗體稀釋液，隨后分組加入50μL 一系列梯度濃度的毒死蜱溶液(10-3~102μg/mL)及作為對照的PBS-T 溶液，每一濃度的毒死蜱溶液設三個平行，37℃溫箱中溫育1h，間接競爭ELISA 試驗毒死蜱對單克隆抗體的抑制標準曲線。酶標儀測定結(jié)果吸光度后，以毒死蜱濃度為橫坐標(以對數(shù)刻度形式表示)，抑制率為縱坐標作標準抑制曲線，求出毒死蜱對單克隆抗體的抑制回歸方程和半數(shù)抑制濃度IC50 值(即當抑制率為50%時的毒死蜱濃度)。其中：抑制率=（上述加不同毒死蜱濃度孔的吸光度值的3 孔平均值）/（對照孔的吸光度值的3 孔平均值）×100%。
2.3.3 單克隆抗體特性鑒定
取克隆化后的細胞株培養(yǎng)上清檢測，分別用0.5μg 的羊抗鼠IgG1、IgG2a、IgG2b 和IgG3包被酶標板，間接ELISA 鑒定單克隆抗體亞類。
2.3.4 交叉反應
性按照毒死蜱間接競爭ELISA 試驗檢測條件分別對殺螟硫磷、對硫磷和馬拉硫磷等與毒死蜱結(jié)構(gòu)相似的有機磷類農(nóng)藥進行交叉反應實驗。將上述農(nóng)藥按一定濃度梯度稀釋,建立它們的抑制標準曲線，并計算各自的IC50，按下述公式計算交叉反應率：交叉反應率=(毒死蜱對單克隆抗體的IC50/其它試驗農(nóng)藥的IC50)×100%
3 結(jié)果
3.1 毒死蜱完全抗原鑒定
紫外掃描光譜結(jié)果（200～360nm）見表1，合成的免疫抗原和包被抗原與載體蛋白BSA、OVA 相比，最大吸收波長發(fā)生發(fā)生明顯的變化，向遠紫外區(qū)偏移；免疫抗原和包被抗原與毒死蜱半抗原最大吸收波長也不一致，這表明合成抗原與載體蛋白及毒死蜱半抗原不是同一種物質(zhì)，間接說明人工抗原的合成是成功的。
3.2 毒死蜱半抗原與載體蛋白結(jié)合比的測定
以系列濃度的磷標準液的吸光度值為縱坐標，磷濃度為橫坐標，做出標準曲線，得到吸光度值對磷濃度的回歸方程y=0.4525x-0.0085。隨后根據(jù)回歸方程求出完全抗原溶液的磷濃度，按式計算合成抗原中磷含量及偶聯(lián)結(jié)合比。免疫抗原和包被抗原中載體蛋白與毒死蜱偶聯(lián)結(jié)合比分別為1：64 和1：19。
3.3 毒死蜱單克隆抗體的制備
免疫抗原免疫 BALB/C 小鼠，小鼠的血清效價以間接ELISA 法檢測到陽性結(jié)果的最大稀釋倍數(shù)表示，結(jié)果顯示效價最高者可達1∶20000。選擇血清效價高者用于細胞融合以制備單克隆抗體。
細胞融合5~7 天左右，倒置顯微鏡下可見大量未融合的細胞明顯退化、縮小，逐漸死亡，并可見有小的雜交瘤細胞克隆出現(xiàn)，雜交瘤細胞大、圓且透亮，以后克隆逐漸長大，約兩周后可長至培養(yǎng)孔底1/5 以上。融合細胞一共接種151 孔，其中44 孔有雜交瘤細胞生長，融合率為29.13%。間接ELISA 檢測，陽性細胞孔5 孔，陽性率為3.31%，陽性孔與陰性血清孔的吸光度值之比最高達到12。
對篩選出的5 孔陽性孔細胞進行競爭抑制實驗，挑選出其中陽性吸光度值較高、抑制效果較明顯的細胞進行有限稀釋法克隆或亞克隆，最終得到2 株能穩(wěn)定分泌毒死蜱抗體的單克隆雜交瘤細胞株。采用正辛酸-硫酸銨沉淀法純化腹水，得到的單克隆抗體溶液稀釋后，使用紫外分光光度法測定抗體濃度為4.08mg/mL。間接ELISA 表明，2 株細胞分泌的抗毒死蜱單克隆抗體均為IgG1 型蛋白。
3.4 間接ELISA 試驗最適工作濃度
用方陣試驗對間接競爭ELISA 法的抗原、抗體的工作濃度進行篩選和確定，結(jié)果見表2。挑選能使吸光度值在1.0 左右而本身值均較小的抗原和抗體的濃度作為間接ELISA 試驗的工作濃度。由表4 選擇間接競爭ELISA 試驗的最適工作濃度是：包被抗原為1μg/ml，抗體為0.4μg/ml。
3.5 毒死蜱對純化后抗體的抑制曲線和檢測靈敏度
以系列濃度的毒死蜱溶液做間接競爭ELISA 試驗，根據(jù)抑制率與毒死蜱濃度之間的關系作圖，得標準曲線。根據(jù)回歸方程y=-0.2669Ln(x)-0.0347，(R2=0.9859)，得出其半數(shù)抑制濃度IC50 為0.135μg/mL，線性檢測范圍為0.04～0.42μg/mL，最低檢測限為0.03μg/mL。
3.6 單克隆抗體特異性研究
分別對毒死蜱及殺螟硫磷、對硫磷、馬拉硫磷做間接競爭ELISA 試驗，結(jié)果見表3，這三種農(nóng)藥與毒死蜱的交叉反應率分別小于0.09%、0.14%、0.05%。
4 討論
毒死蜱屬于小分子物質(zhì)，其自身不具備免疫原性，必須先與免疫原性較強的大分子物質(zhì)相偶聯(lián)，制備人工抗原，才能刺激機體產(chǎn)生抗體。人工抗原的合成是農(nóng)藥殘留免疫分析中制備抗體和建立免疫分析方法的關鍵步驟，而半抗原的合成則是人工抗原合成的前提。農(nóng)藥分子半抗原設計時應使半抗原最大限度的保留農(nóng)藥分子的特征化學結(jié)構(gòu)，以便農(nóng)藥分子能被免疫活性細胞所識別，制備出特異性強，親和力高的抗體。本研究選擇在苯環(huán)上引入活性基團羧基，采用碳二亞胺法合成毒死蜱免疫抗原和包被抗原，經(jīng)紫外光譜掃描鑒定后，間接證明成功合成人工抗原。合成的毒死蜱免疫抗原與包被抗原中載體蛋白與毒死蜱的結(jié)合比分別為1∶64 與1∶19，與相關文獻相比結(jié)合比稍偏大。但是人工抗原的結(jié)合比大小沒有絕對的標準，各報道也不一致[13]，人工抗原的結(jié)合比稍大，將有更多的半抗原分子可以暴露在外面，理論上將增加機體產(chǎn)生抗毒死蜱抗體的能力。
在農(nóng)產(chǎn)品及環(huán)境農(nóng)藥殘留分析中，單克隆抗體與常規(guī)抗體相比有如下優(yōu)點：①單一特異性，只與同一抗原決定簇反應，不易產(chǎn)生交叉反應；②可重復性，由于來自統(tǒng)一細胞，能夠提供完全一樣的抗體制劑，易于標準化管理；③一經(jīng)制出，可無限量地供應，適宜規(guī)模化生產(chǎn)；④生產(chǎn)單克隆抗體，可以用不純的抗原作為免疫原；⑤能查出混合物中存在的用常規(guī)方法查不出的少量成分。由于McAb 具有特異、靈敏、快速、簡便、痕量檢測以及可大批量樣本檢測的優(yōu)點，日益顯示出強大的應用價值和前景。基于單克隆抗體的酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)，是在免疫酶技術的基礎上發(fā)展起來的一種免疫測定技術，它是一種在固相載體上進行的免疫酶反應，其檢測核心是利用抗原抗體之間的特異性吸附，在固相載體上層層疊加，可以是2 層、3 層甚至更多層，而只進行一次酶促反應使底物顯色，從而對待測物進行定量或定性分析。它可特異、快速、簡便地檢測農(nóng)藥殘留，尤其適用于現(xiàn)場控制農(nóng)藥、蔬菜、水果中的農(nóng)藥殘留，對發(fā)展無污染農(nóng)產(chǎn)品，保障人體健康發(fā)揮著重要作用。本研究初步建立了檢測毒死蜱的間接競爭ELISA 方法，半數(shù)抑制濃度IC50 為0.135μg/mL，線性檢測范圍為0.04～0.42μg/mL，最低檢測限為0.03μg/mL，低于常規(guī)氣相色譜法對毒死蜱的儀器檢出限0.05mg/L。特異性研究結(jié)果表明制備的單克隆抗體與殺螟硫磷、對硫磷和馬拉硫磷三種與毒死蜱結(jié)構(gòu)相似的有機磷類農(nóng)藥幾乎沒有交叉反應，該單克隆抗體特異性較好。
本研究初步建立的間接ELISA 法檢測毒死蜱的半數(shù)抑制濃度IC50，與其他研究者[6, 12]
制備的毒死蜱多克隆抗體相比，靈敏度相當；與國外的毒死蜱單克隆抗體相關研究結(jié)果比較[11, 12]，本研究ELISA 試驗的靈敏度相對偏低，兩者相差了1 個數(shù)量級，與國內(nèi)相比[14]，靈敏度相當。分析靈敏度與國外研究結(jié)果相比偏低的原因可能由于ELISA 反應體系中影響因素較多：包被抗原及抗體的濃度，酶標二抗的稀釋倍數(shù)，反應的溫育時間，洗滌次數(shù)，緩沖液的pH 值，封閉液的選擇等都會對試驗的結(jié)果有影響，而本研究僅對不同的包被抗原和抗體濃度方面進行了研究篩選，因此可能尚沒有摸索出該抗體ELISA 的最佳反應條件，如果繼續(xù)就以上因素進一步優(yōu)化，試驗靈敏度會有所提高。而且本次試驗中所用毒死蜱標準溶液是以毒死蜱原藥配制的，純度只有98.8%，如果換用高純度的毒死蜱標準品配制，也會提高試驗靈敏度。此外因為小鼠腹水含有雜蛋白，只采用正辛酸-硫酸銨沉淀一步純化法，不可能得到高純度的抗體，將此純化后的抗體再過一次DEAE 離子交換層析柱或羥基磷灰石柱，或者直接進行免疫親合層析純化將會得到更純的抗體，這也將有助于提高ELISA 試驗的靈敏度。因此，本研究應進一步提高該方法的靈敏度，并對準確度、精密度和重復性做深入的研究分析，為開發(fā)檢測毒死蜱的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒奠定基礎。
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