lonza 無血清 培養基
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牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)在分類學上屬黃病毒科(Flaviviridae)，瘟病毒屬(Pestivirus)成員，與屬內的豬瘟病毒(classi—calswinefever virus，CSFV)及羊邊界病毒(borderdiseasevirus，BDV)在血清學上有交叉反應。BVDV感染的牛能引起多種臨床癥狀，如高熱、腹瀉、流涎、停食、白細胞減少、免疫抑制、黏膜充血等，還能引起奶牛產奶量下降，孕牛流產、產死胎及牛的持續性感染。野生反芻動物對BVDV非常敏感，尤其是鹿科動物更易感，在南達科他東南部的兩頭白尾鹿體內檢測到了BVDV，并且在幼鹿中可持續感染。E2囊膜糖蛋白是BVDV抗原性的主要決定部分，同時又是變異率較高的一種結構蛋白，其變異可引起BVDV中和逃逸，導致動物持續感染。BVDV的檢測方法也很多，Semrau等用熒光定量PCR對大量的樣品進行了檢測，結果發現從血清樣品中檢測到BVDV呈陽性的樣品數量比口、鼻分泌物樣品多。酶聯免疫試驗(ELISA)具有敏感、準確、快速、簡單等優點，結合單抗應用具有很大的優勢，抗BVDV單克隆抗體在牛病毒性腹瀉病臨床診斷，特別在研究BVDV抗原基因變異方面起著重要作用。我們在研究中用BVDVE2表達蛋白免疫Balb／c小鼠，研制出5株單抗，并在此基礎上開展了抗原捕獲ELISA(AC-ELISA)的研究工作。
1 材料與方法
1．1 病毒、單抗和陰性腹水
sf9昆蟲細胞表達的BVDVE2蛋白來自軍事獸醫研究所病毒室，抗BVDV E2蛋白單克隆抗體4G3(ELISA效價1．8X10 5)自制。陰性腹水自制。
1．2 試驗動物
1．5—2．0 kg的健康雌性家兔購自衛生部長春生物制品所，用于制備多抗。新生小牛購自長春市郊奶牛場，試驗前檢測BVDV為陰性，用于制備陰性小牛血清。
1．3 主要試劑
蛋白A凝膠(ProteinA Sepharose)及抗體純化層析柱購自BIOTECH公司，HRP標記的羊抗兔IgG、鄰苯二胺(OPD)、四甲基聯苯胺(TMB)等均購自SIGMA公司。細胞培養基Grace為GIBCOBRL公司的產品；PAGE低分子量蛋白Marker購自TAKARA公司；PEG600購自上海生物工程有限公司；BCA試劑盒購自Pierce公司。
1．4 單抗純化鑒定
將IgM亞型的單抗4G3采用PEG6000純化，純化后的單抗用SDS-PAGE鑒定純度和BCA試劑盒測定濃度后低溫保存備用。
1．5 多抗的制備、純化和濃度測定
以弗氏完全佐劑(FCA)乳化桿狀病毒表達并純化的BVDVE2蛋白免疫家兔，分點皮下注射1 000μg／只，共免疫3只。2周后以弗氏不完全佐劑(FIA)乳化蛋白分點皮下注射相同劑量，最后一次免疫，直接用生理鹽水稀釋蛋白皮下注射1 000μg的重組E2蛋白抗原。2周后采血測抗體效價。待抗體達到要求后殺兔采血，分離血清。將兔血清采用蛋白A(Protein A Sepharose)柱層析法純化，純化后的IgG用SDS-PAGE鑒定純度和BCA試劑盒測定濃度后低溫保存備用。
1．6 NP-40處理制備BVDV抗原
將桿狀病毒表達BVDV E2蛋白的sf9細胞接種至細胞培養瓶，待鋪滿整個瓶底時將細胞培養物反復凍融3次，1 503 g／min離心，收集細胞上清原液，加人1％細胞原液量含1％NP-40的PBS緩沖液，室溫旋渦震蕩1．5-2 h，然后601 g／min 4℃離心10min，上清作為被檢陽性抗原，用同樣方法處理的sf9細胞上清作為陰性對照。
1．7 單抗和多抗最佳使用濃度的篩選
采用方陣滴定法，將純化后的單抗和多抗分別稀釋至20 μg／mL、10μg／mL、5μg／mL、2 μg／mL、1 μg／mL、0．5μg／mL 6個不同濃度，包被酶標板，4℃過夜后，以1％BSA的PBS溶液37℃封閉1 h，用0．15％吐溫-20的PBS洗3次后加入NP-40處理的BVDV細胞培養抗原，同時加入同種方法處理的正常細胞培養物做陰性對照，37 ℃作用1 h；用含1％明膠的PBS溶液37 ℃封閉1h；加入不同濃度的兔抗BVDVIgG(20、10、5和2μg／mL)，37 ℃作用1 h；洗滌后加入羊抗兔酶標抗體(Sigma)，37 ℃作用1 h；再次洗滌后加入新配的底物溶液TMB+H2O2，37 ℃作用15 min；用2mol／LH2SO4溶液終止后檢測OD450值，確定抗體的最佳工作濃度。
1．8 單抗包被條件和多抗作用條件的確定
采用方陣滴定法，將篩選的單抗和多抗分別按最佳使用濃度稀釋，單抗采用37℃2 h、4℃12 h、4℃24h和37℃1 h后4℃ 12h4種包被條件，多抗則采用37 ℃分別作用2h、1 h和30min的工作條件，按1．7步驟進行ELISA，分別檢測NP-40處理的陰、陽性抗原，根據結果選擇單抗的最佳包被條件和多抗的最適作用條件。
1．9 封閉劑的應用選擇
用單抗包被酶標板，分別用1％BSA、1％明膠、1％BSA+1％明膠、1％BSA+1％明膠應用2次(單抗包被后和待檢抗原作用后)4種方式封閉，然后按1．7步驟進行ELISA，分別檢測NP-40處理的陰、陽性抗原，根據結果選擇封閉劑的最佳應用方法。
1．10 酶標抗體工作條件的選擇
酶標抗體分別按1：100、1：1 000、1：10 000、1：100 000倍稀釋，反應條件為37℃分別作用2h、1 h和30min，按1．7步驟進行ELISA，分別檢測NP-40處理的陰、陽性抗原，根據結果選擇酶標抗體的最佳工作濃度和作用時間。
1．11 AC-ELISA方法陰性樣品臨界值的確定
以24份來自健康牛的脾臟組織懸液為待檢測樣品，進行上述AC—ELISA。每份樣品重復2孔，在樣品OD450值符合正態分布的條件下計算樣品平均OD450值(x)和標準差(s)，按文獻計算陰性樣品的臨界值。
1．12 AC-ELISA重復性試驗
用單抗包被4塊酶標板，在每一塊板內分別檢測1份BVDV細胞培養抗原和4份牛病毒性腹瀉病組織病料，同時用1份正常細胞培養物做陰性對照，每份樣品在每塊板中重復4孔，AC-ELISA方法進行檢測。結果用SPSS軟件進行統計學分析，計算樣品OD450值在不同板間和板內不同孔間的變異系數，檢驗板內和板間檢測樣品的重復性。
1．13 AC-ELISA在臨床牛病毒性腹瀉病樣品檢測中的應用
11份臨床牛病毒性腹瀉病疑似病例脾臟組織和12份健康牛脾臟組織，分別研磨勻漿后用1％NP-40處理，用AC-ELISA方法檢測BVDV抗原，同時用正常細胞培養物做陰性對照。上述樣品分別用病毒分離和RT-PCR方法平行檢測做對比。
2 結果
2．1 單抗純化鑒定和濃度測定
純化前后的單抗SDS-PAGE如圖1，由圖可見純化后的單抗在68 ku和25 ku附近有兩條明顯的條帶(分別是IgM的重鏈和輕鏈)，與預期的大小條帶相符。而未純化的泳道上出現多條雜帶。表明單抗純化結果較理想。
2．2 多抗效價測定、純化和濃度測定
采用倍比稀釋法測得純化后的多抗效價為1．2X10 4。純化前后的多抗SDS-PAGE如圖2，圖中顯示IgG在50ku和25 ku附近出現了明顯的條帶，代表IgG的重鏈和輕鏈，與預計大小相符，未純化多抗則有很多雜帶。表明上述純化結果很理想。經BCA試劑盒方法測定多抗的濃度為9．08 mg／mL。
2．3 單抗和多抗最佳使用濃度的篩選
方陣滴定法篩選單抗和多抗最適工作濃度，結果見表1。單抗4G3和兔抗BVDVIgG濃度分別為5和10μg／mL時，檢測BVDV細胞培養抗原的OD450值為1．023，接近于1．0，且正常細胞培養物的OD450值為0．312，P／N值(3．278)最大，確定AC—ELISA試驗中單抗和多抗的最適工作濃度分別為5和10μg／mL。
2．4 單抗包被條件和多抗作用條件的確定
以最適單抗濃度采用37 ℃ 2h、4 ℃ 12h、4 ℃24h和37℃1 h后4℃12h4種包被條件，多抗則采用37℃分別作用2h、1 h和30 min 3種不同的工作條件，組成方陣進行AC-ELISA，分別檢測NP-40處理的陰、陽性抗原，結果見表2。
單抗在4℃包被12 h，多抗在37 ℃作用1 h，BVDV陽性抗原OD450值1．032，陰性OD450值0．320，P／N值為3．225；單抗在4℃包被24 h，多抗在37℃作用1 h，BVDV陽性抗原OD450值1．066，陰性OD450值0．315，P／N值為3．384。此兩種條件下的陽性抗原OD450值均接近1．0，P／N值均較大，單抗在4℃包被12—24h，多抗在37℃作用1 h可作為雙抗體的最佳反應條件。
2．5 封閉劑的應用選擇
分別用1％BSA、1％明膠、1％BSA+1％明膠、1％BSA+1％明膠應用2次(單抗包被后和待檢抗原作用后)4種方式封閉后進行AC-ELISA，分別檢測NP-40處理的OD450值BVDV陰、陽性抗原，結果見圖3，用1％BSA+1％明膠封閉2次，陽性抗原OD450值最高，陰性抗原OD450值最低，P／N值最大，為最佳封閉條件。
2．6 酶標抗體的工作濃度和工作時間的選擇
羊抗兔IgG分別做1：100、1：1 000、1：10 000、1：100 000倍稀釋，在37℃分別作用2h、1 h和30 min，進行AC-ELISA，檢測NP-40處理的BVDV陰、陽性抗原，結果見表3，酶標抗體按1：10000稀釋后37 ℃作用1 h，測得BVDV陽性抗原OD450值最高，陰性抗原的OD450值較低，P／N值較大，為最佳反應條件。
2．7 AC-ELISA方法陰性樣品臨界值的確定
用AC—ELISA方法檢測24份BVDV陰性的牛組織樣品，其OD450值介于0．242和0．346之間(圖4)。用SPSS 8．0軟件進行統計學分析，24份樣品的OD45。值符合正態分布，OD450值的平均數(x)和標準差(s)分別為0．301和0．031，根據文獻計算陰性樣品的臨界值為x+3xs=0．393。根據統計學原則，OD450值>0．393時，可以在99．9％的可信度上判定為陽性，能夠作為檢測結果的判斷標準。為了減少假陽性或假陰性結果，將臨界值加上和減去1個標準差的范圍作為一個可疑區間(即OD450值0．362—0．424)，介于可疑區間內的結果需要重檢。
2．8 AC-ELISA方法的重復性試驗
用已建立的AC—ELISA方法對1份陽性抗原(BVDV細胞培養物)、1份陰性抗原(陰性細胞培養物)和4份疑似BVDV感染牛的脾臟組織分別在不同板間及板內不同孔間進行重復檢測，結果見表4。根據SSPS 8．0統計軟件中的隨機單位組設計資料的S-N-K方差分析方法進行分析。不同板間比較，F=0．833，P=0．479>0．05；板內不同孔間比較，F=0．103，P=0．958>0．05。二者差異均無顯著意義，說明AC-ELISA方法在不同板間和板內不同孔間檢測同一樣品差異不顯著。根據公式CV=S／Xx100％計算，6個樣品在板內和板間的總變異系數均小于10％，可見該方法無論對陰、陽性細胞培養抗原還是臨床組織樣品進行檢測均具有較好的重復性。
2．9 AC-ELISA在臨床牛病毒性腹瀉病樣品檢測中的應用
用AC—ELISA方法檢測臨床采集的牛病毒性腹瀉病料，同時以病毒分離和RT-PCR方法檢測做對比。用AC-ELISA、病毒分離和RT-PCR方法對11份臨床牛病毒性腹瀉病料的檢測結果分別見表5，3種方法對12份健康牛組織樣品的檢測結果均為陰性。
3 討論
牛病毒性腹瀉至今仍是世界范圍內嚴重威脅養牛業健康發展的傳染病，各國對該病都十分重視，投入很大的人力和物力進行研究。就目前BVDV的診斷技術研究水平來看，遠遠滯后于BVDV其他方面的研究進展，如何建立快速、準確的BVDV檢測方法是當前BVDV防制工作的迫切要求。多年來，國內外先后建立了病毒分離、免疫熒光試驗、單層免疫酶、酶聯免疫酶和RT-PCR檢測方法。ELISA方法以其快速、靈敏、簡單并便于同時檢測大量樣品而受到人們的重視。目前國內BVDV檢測方法還是以初步純化的BVDV細胞培養物作為抗原檢測BVDV抗體為主，缺乏理想的BVDV抗原檢測方法。由于國外抗原檢測試劑盒價格過于昂貴，在國內難以推廣，建立一種敏感、快速、易操作的直接檢測牛病毒性腹瀉病抗原的試驗方法已成為BVDV診斷工作的迫切要求。本試驗用自行研制的BVDV單抗與兔抗BVDVIgG聯合應用，建立了雙抗體夾心間接ELISA方法用于捕捉BVDV抗原，將單抗的高度特異性和ELISA方法的高度敏感性有機地結合起來，達到了BVDV早期診斷和快速檢測的目的。AC-ELISA方法具有快速、經濟和敏感等優點，明顯優于病毒分離、IPMA和IFA等，而且具有半自動化的特點，能自動顯示結果，因此更適宜于短時間內檢測大批量樣品，適合于各級獸醫研究機構和生產單位應用。
在AC-ELISA方法的建立中抗體的親合力是試驗成功的關鍵，只有制備出高效價、高親合力的特異性抗體才有可能取得成功。我們研制的單抗效價高，親合力強，為方法的建立打下了良好的基礎。同時制備了兔抗BVDV高免血清并純化了IgG，取得了較好效果。
非特異性反應是影響ELISA結果最重要的因素，特別是在雙抗體夾心ELISA中，參與反應的成分多，需要多重抗原抗體反應步驟，因此降低非特異性反應尤其重要。在消除非特異性反應過程中，封閉劑的選擇和合理應用非常關鍵。由于擔心動物血清中未知雜蛋白含量過多，有可能對試驗結果造成影響，本試驗中采用BSA和明膠作為封閉劑，并進行了封閉方式篩選試驗，確定了將1％BSA和1％明膠分別在抗體包被后和加入待檢抗原反應后進行兩次封閉，取得滿意效果。
ELISA方法中結果的判定與特異性和敏感性密切相關，目前還沒有統一的判定標準，一般公認的判定方法是通過檢測大量已知的陰性樣品，用統計學方法計算結果的平均數、平均數的99％可信區間和標準差，確定一個在99％的可信度上區分陰、陽性結果的臨界值。張札壁報道對10份以上已知陰性樣品分別檢測，取OD值平均值加上3倍標準差的和可作為臨界值，當被檢樣品的OD值高于此值時，可判定為陽性。本試驗中應用24份經病毒分離和RT-PCR方法鑒定為BVDV陰性的牛脾臟組織分別用AC—ELISA方法進行檢測，采用平均數加3倍標準差的方法確定樣品陰性臨界值為0．393，根據統計學原則，凡未知樣品的OD值高于此值時，可以在99．9％的可信度上判定為陽性，能夠作為檢測結果的判斷標準。此外，本試驗還設定了一個可疑值范圍，對介于可疑區內的樣品進行重檢，減少了假陽性或假陰性結果機率。
總之，本試驗建立的BVDVAC-ELISA方法將單抗的特異性和ELISA方法的敏感性有機地結合起來，能夠短時間內準確、快速地直接檢測大批量樣品中的BVDV抗原，明顯優于病毒分離和免疫熒光等方法，而且具有半自動化的特點，能自動顯示結果，更適合于各級獸醫研究機構和生產單位應用。
lonza 無血清 培養基
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