生理學報 2001年第4期第53卷
1第四軍醫大學生理學教研室；西安 710032；2中國科學院上海生物化學研究所；上海 200031
郭海濤1；朱妙章1；*；呂順艷1；于軍1；董明清1；高瞻1；施溥濤2
關鍵詞：血管鈉肽；低氧；心成纖維細胞；Ca2+
摘要：為了觀察血管鈉肽(vasonatrin peptide, VNP)對低氧作用時心成纖維細胞增殖的影響, 將分離純化乳鼠心成纖維細胞, 隨機分為4組:對照組、 低氧組(2%～3%)、 VNP組(10－８～10－６ mol/L)和VNP+低氧組。用MTT比色法、 ~3H-TdR摻入法觀察細胞增殖情況,采用激光共聚焦方法研究VNP對細胞內鈣濃度(［Ca2+］i)水平的影響。旨在探討VNP對低氧刺激心成纖維細胞增殖的影響及機制。我們發現,低氧可以使培養的乳鼠心成纖維細胞MTT光吸收值(OD值)較對照組顯著增高(P＜0.05)。VNP (10－６ mol/L)可以顯著降低低氧刺激的心成纖維細胞MTT oD值和細胞內 ~3H-TdR摻入量的增高(P＜0.05)。對照組［Ca2+］i水平無顯著差異, 低氧組［Ca2+］i水平顯著升高, 而VNP (10－６ mol/L)能使升高的［Ca2+］i水平較對照組、 低氧組顯著降低(P＜0.05)。結果表明, VNP能減弱低氧對心成纖維細胞生長的刺激作用,其機制可能與Ca2+等信號轉導分子有關。低氧性心肌肥厚是高原性心臟病的主要表現之一,是低氧性肺動脈高壓向心力衰竭發展的一個病理過程［1］。其形成過程與心臟負荷以及內皮素(ET-1)、血管緊張素Ⅱ (AngⅡ)、生長因子等眾多的因素有關［2～6］。低氧導致的交感神經興奮性增強, 心肌細胞及心成纖維細胞自分泌、 旁分泌增強， 各種體液因素促進心成纖維細胞分裂增殖、分泌膠原及其它間質成分, 是低氧性心肌肥厚形成的可能機制之一［3～6］。降低細胞內Ca2+水平的心房鈉尿肽(atrial natriuretic peptide, ANP)有抑制低氧致肥大的效應［7,8］。血管鈉肽(vasonatrin peptide, VNP)是一種由27個氨基酸殘基組成的人工合成多肽,是ANP和C型利鈉尿肽(CNP)的嵌合體, 與ANP和CNP有高度的結構同源性, 因此, 可能有相似的藥理效應。動物實驗證明VNP可以降低肺動脈高壓大鼠的右心室重量(反映右心室肥厚的指標)［9,10］,這可能是降低右心室后負荷的結果, 但是否有直接抑制心成纖維細胞生長的作用, 目前國內外報道很少。因此, 本實驗的主要目的是觀察VNP對低氧刺激的心成纖維細胞生長的影響及其可能的機制。
1材料和方法
1.1 材料 SD乳鼠(1～2 d): 由本校實驗動物中心提供, 胰酶由DIFCO公司生產, 膠原酶、 EDTA、 DMEM培養基、 小牛血清為GIBCO公司產品, vNP由中國科學院上海生物化學研究所提供, 3HTdR由中國科學院上海核技術開發公司生產, Brdu為Sigma公司產品, MTT為西安華美試劑公司生產,酶聯免疫分析儀和LS6500液體閃爍計數器為美國Beckman公司產品, 1H21A型Expired gas monitor為日本3A公司產品。
1.2 方法
1.2.1 主要藥物配制VNP: 用生理鹽水配成10－３ mol/L的原液, 4℃保存, 實驗前用DMEM培養基稀釋成工作液。DMEM培養基: 按說明書配制,用0.1 mol/L的鹽酸調pH至7.2～7.4, 4℃保存備用。小牛血清: 56℃滅活30 min, －20℃保存。胰蛋白酶: 用生理鹽水配成2.5 g/L的溶液, 4℃保存備用。EDTA: 用生理鹽水配成0.4 g/L的溶液, 4℃保存備用。膠原酶: 用生理鹽水配成1.5 g/L的溶液,4℃保存備用。MTT溶液:用生理鹽水配制, 使用濃度為5 g/L, 用0.22 μm微孔濾器過濾除菌后分裝, 4℃保存。2周內有效。閃爍液: PPO 2.5 g, POPOP 0.25 g溶于500 ml二甲苯中, 搖2～3 次/日, 3～5 d后使用。避光保存。
1.2.2 心成纖維細胞培養于無菌條件下取出乳鼠的心臟, 剪碎, 以1.25 g/L胰蛋白酶及0.75 g/L的膠原酶消化成單細胞懸液, 離心(1*#000 r/min, 5 min), 用含0.1 mmol/L BrdU及100 ml/L滅活小牛血清的DMEM培養基重新懸浮, 貼壁90 min后將懸浮細胞吸棄,加入含100 ml/L滅活小牛血清的DMEM培養基傳代至2～4代時, 將心成纖維細胞以5×107/L接種于96孔培養板(用于MTT比色或測~3H-TdR)或100 ml的玻璃培養瓶(用于傳代), 之后, 移入37℃、 5% CO2培養箱中培養。若細胞貼壁并已伸展但未匯合 (subconfluent),用臺盼藍拒染法檢查活細胞數超過95%, 可供以后實驗用。
1.2.3 心成纖維細胞的鑒定在倒置顯微鏡下觀察, 細胞呈梭形、 多角形, 細胞質透明, 細胞核明顯變大, 呈橢圓形, 常含有2～3個核。用SABC法免疫組織化學染色,將心成纖維細胞以5×107/L接種于24孔培養板(預置于10 mm×10 mm蓋玻片上), 待細胞爬片至接近融合時, 將24孔培養板內細胞以40 g/L的多聚甲醛固定(4℃、 20 min), 然后以15 g/L的正常羊血清孵育30 min, 以封閉組織中的抗體非特異性結合位點。將2 g/L BSA/0.5 g/L NaN3/PBS稀釋的Ⅰ抗體 (分別為動物抗人FN、 抗波形蛋白、 抗血管平滑肌肌動蛋白) 加至玻片上, 4℃孵育48 h, 再依次在生物素化抗IgG(1∶400)和ABC液(1∶200)中分別孵育2.5 h (25℃)。最后用硫酸鎳銨葡萄糖氧化酶法呈色, 蘇木素復染, 經脫水透明后封片。
1.2.3 細胞低氧培養方法將接種于培養瓶或培養板的細胞放置于一體積約7 L的真空干燥瓶中, 通入95% N2和5% CO2的混合氣體, 以2 L/min,通氣12 min, 使真空干燥瓶中氣體濃度達到2%～3% O2和5% CO2。用Expired gas monitor分別檢測真空干燥瓶中0, 6、 12、24、 48 h的氣體濃度。在0～24 h， 氣體濃度可維持在2%～3% O2和5% CO2。
1.2.4 MTT比色法將心成纖維細胞以5×107/L 每孔100 μl接種至96孔板, 將不同培養板隨機分為兩組, 同一培養板又按豎排隨機分為4組: 對照組、 vNP組(10－８～10－６ mol/L)及低氧組(2%～3%)、 以及VNP (10－８～10－６ mol/L)+低氧組。24 h后換為各種濃度的藥物,置于低氧或常氧環境24 h, 以5 g/L, 每孔20 μl加入MTT。4 h后吸棄液體, 以每孔150 μl加入DMSO, 輕輕震蕩10 min,用酶聯免疫分析儀測光吸收值。
1.2.5 ~3H-TdR取對數生長期細胞將心成纖維細胞以5×１０７/L 每孔100 μl種至96孔板。 將不同培養板隨機分為兩組,同一培養板又按豎排隨機分為5組: 對照組、 VNP組(10－８～10－６ mol/L)、 2.5×10－4 mol/L維拉帕米組及低氧組(20～30 ml/L)、 VNP (10－８～10－６ mol/L)+低氧組、 2.5×10－4 mol/L維拉帕米+低氧組。24 h后換為各種濃度的藥物,每孔加入11.1 kBq ~3H-TdR, 置于低氧或常氧24 h, 多頭細胞收集器收集細胞至玻璃纖維濾紙上, 烤干。將玻璃纖維濾紙置于閃爍計數管中,每管加入閃爍液0.5 ml, 用液態閃爍計數儀測定放射性。
1.2.6 細胞內Ca2+的測定將心成纖維細胞以１０7/L, 每皿0.3 ml接種至中心有孔的培養皿上(培養皿底部中心鉆直徑為1.5 cm的孔, 將20 mm×20 mm蓋玻片用中性樹膠粘在培養皿底部)。待細胞貼壁后, 用臺氏液洗滌細胞2次, 于37℃避光條件下用fluo-3/AM (10 μmol/L)荷載,50 min后用臺氏液洗滌3次, 洗去殘余染料。用共聚焦顯微鏡動態掃描細胞內鈣的熒光強度變化。
1.2.7 數據的統計學分析實驗數據以mean±SD表示, 兩組均數采用t檢驗, 多組間均數采用Origin5.0軟件中單因素方差分析進行統計學處理。P＜0.05為相差顯著, P＜0.01為相差非常顯著, P＞0.05無顯著差異。
2結果
2.1 VNP對低氧刺激的心成纖維細胞MTT OD值的影響
培養板在常氧時心成纖維細胞受不同濃度VNP作用后, MTT OD值與對照組無明顯差異。放入低氧環境后, 低氧可以使心成纖維細胞MTT oD值增加。對照組OD值為0.30±0.02, 當放入低氧環境中OD值為0.35±0.04, 較對照組增加17%(P＜0.05)。VNP可以降低低氧刺激的心成纖維細胞OD 值。 當低條見下加入 10－7 mol/L VNP 時, OD 值為0.31±0.03,較低氧組降低11% (P＜0.05); 加入10－６ mol/L VNP時, OD值為0.30±0.02, 較低氧組降低14% (P＜0.01)。
2.2 VNP對心成纖維細胞內 ~3H-TdR摻入水平的影響
低氧使心成纖維細胞 ~3H-TdR摻入水平顯著增高, VNP可顯著降低低氧時 ~3H-TdR的摻入水平, 而且有劑量依賴性。對照組為(100±7)% cpm,低氧時為(129±14)% cpm, 當加入10－８、 10－７ mol/L和10－６ mol/L VNP后, 分別降為(105±8)% cpm、(95±14)% cpm (81±7)% cpm, 較低氧組分別降低18.6%、 26.3%及37.2% (P＜0.05)。當加入2.5×10－4 mol/L維拉帕米后, 低氧及常氧組的值均降低, 而且與對照組相比有顯著性差異(P＜0.01)。
2.3 VNP對心肌細胞內Ca2+水平的影響
低氧使心成纖維細胞內Ca2+水平顯著升高, VNP可使升高的細胞內Ca2+水平降低. 對照Ca2+水平為(2.30±0.21)U,低氧時Ca2+水平為(4.45±0.36)U, 用VNP時Ca2+水平為(2.96±0.11)U, 顯著小于低氧組(P＜0.05)。
3討論
低氧刺激心成纖維細胞生長的機制還不是很清楚, 但低氧引起肺動脈高壓, 其機械刺激可導致心成纖維細胞分裂增殖是低氧性心肌肥厚形成的可能機制之一［2］,低氧還導致交感神經興奮性增強, 心肌細胞及心成纖維細胞自分泌、 旁分泌增強, 多種激素［3～6］促進心成纖維細胞分裂增殖和分泌膠原及其它間質成分,后者的作用可能起更重要的作用。這方面的研究正引起學者的注意和興趣。
booz等報道, 在乳鼠心成纖維細胞, AngⅡ刺激的DNA合成至少有一部分是通過依賴Ca2+通道的［11］。Hou 等報道, 在人類AngⅡ刺激心成纖維細胞蛋白合成,是通過Ca2+敏感依賴PKC酪氨酸激酶途徑的［12］。Angelino C等報道, l-型Ca2+通道阻斷劑維拉帕米和尼莫地平可抑制去甲腎上腺素(NE)引起的心肌細胞 ~3H-亮氨酸和心成纖維細胞 ~3H-TdR摻入, 而且ANP、 S-nitroso-N-acetyl-D、 l-Penicillamine (SNAP)不能增強這種效應。在心肌細胞, Ca2+通道激動劑Bay-K8644可增強 ~3H-亮氨酸的摻入, 此效應可被ANP抑制。說明ANP可減弱NE引起的心肌細胞及心成纖維細胞增殖作用,這一作用主要是通過抑制NE刺激的cGMP介導的Ca2+內流［13］。
心肌肥厚是細胞促增殖和抑增殖因素失去平衡的結果, 以往的研究多集中于促增殖因子如ET-1、 AngⅡ等, 但是從治療的角度看,對抑增殖因子的研究具有更重要的意義。Cao等［14］報道, ANP、 NO和cGMP能抑制生長因子、 AngⅡ和ET-1刺激的心臟成纖維細胞的DNA 合成。
對ANP、 CNP、 VNP生理作用的研究最初集中在其利鈉利尿和舒張血管等方面, 近來研究表明它們還有抑制多種細胞增殖的作用。如Neuser等［15］的研究表明ANP抑制ET-1刺激血管平滑肌細胞的增殖作用, galderone等［13］發現ANP抑制NE刺激心肌細胞、心成纖維細胞的生長, Arjona等［16］發現CNP抑制血管平滑肌細胞增殖和肥大,國內吳建明等［17］的研究表明 ANP可以抑制血管平滑肌和心肌細胞的增殖和c-fos蛋白的表達。董明清等［18］的研究表明VNP可抑制肺動脈平滑肌細胞增殖。于軍等［19］的研究表明VNP可減弱NE對心肌生長的刺激作用。
心成纖維細胞可分泌ET-1, ET-1主要通過ETA受體介導引起DNA合成增強。AngⅡ刺激ppET-1和c-fos mRNA聯合表達可能是通過激活蛋白激酶C(PKC)介導［4］。最近報道, 在心成纖維細胞中ANP、 BNP抑制ET-1、 AngⅡ刺激的DNA和ppET-1 mRNA的表達［5］。心成纖維細胞有大量的與鳥苷酸環化酶結合的鈉尿肽受體, ANP是通過三種鈉尿肽受體亞型起作用的［20］, ANP、 BNP升高心成纖維細胞內的cGMP。ANP通過cGMP直接抑制L型Ca2+通道,使心成纖維細胞內Ca2+濃度降低, 抑制心成纖維細胞生長。VNP是人工合成的多肽, 是由ANP羧基末端5個氨基酸殘基和CNP組合而成, 結構上與ANP、 CNP有很高的同源性,可能具有ANP和VNP的一些功能, 并通過相同的途徑發揮生理效應。
目前, VNP通過何種受體發揮作用尚不清楚。已知ANP、 CNP主要是通過與膜上鳥苷酸環化酶(GC)耦聯受體GC-A、 GC-B結合激活GC, 升高胞內cGMP水平來發揮生理作用,亦可與非GC耦聯的C受體結合介導自身清除或其它作用。由于VNP系人工設計合成, 體內因缺乏特異的降解酶, 克服了其它鈉尿肽代謝快、 半衰期短的缺陷。本研究表明, vNP可以抑制低氧刺激的心成纖維細胞增殖, 并且有劑量依賴性, VNP可以降低低氧引起的細胞內Ca2+水平升高,而細胞內Ca2+濃度的升高可以促進心成纖維細胞生長。說明VNP在肺動脈高壓、低氧性右心室肥厚、 慢性心力衰竭等疾病的治療中, 可能較ANP、 CNP具有較大的潛在應用價值。
鈉尿肽受體、 第二信使和L型Ca2+通道等是VNP信號轉導途徑中的幾個環節, 在從VNP作用于鈉尿肽受體到心成纖維細胞的形態、 功能改變的過程中,對Ca2+通道以及PKC下游多級信號分子活性的影響, 需要應用膜片箝和分子生物學等技術進一步深入研究。
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received 2000-10-22Accepted 2001-01-13
this work was supported by the National Nature Science Foundation of China(No.39970327)
*Corresponding author. Tel: 029-3374574; Email:mz_zhu@fmmu.edu.cn
本文來自:大眾醫藥網
http://www.51qe.cn/pic/30/15/11/23/0454.htm
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