概述
●ELISA是一種敏感性高、特異性強、重復性好的實驗診斷方法，由于其試劑穩定、易保存、操作簡便、結果判斷較客觀等因素，以及既適宜于大規模篩查試驗又可以用于少量標本的檢測，既可以做定性試驗也可以做定量分析等優點，已廣泛應用于微生物學、寄生蟲學、腫瘤學和細胞因子等領域。ELISA的影響因素較多，加強質量管理才能充分發揮其方法學的優點。
分析前質控
●人員培訓 實驗是***作的，因此檢驗人員需經過培訓，熟練掌握本專業如下幾方面的技術知識：
◎檢驗項目的基本原理 （ELISA原理）；
◎臨床意義；
◎熟悉檢測技巧，了解易出差錯的環節及難點；
◎熟悉檢測試劑性能（包括試劑盒組成，包被片段及其組成）；
◎ 熟悉檢測儀器的原理及性能；掌握數據處理的能力和質量控制知識。
◎某些特殊項目的檢測如抗HIV等需經有關部門組織的專門培訓班，考試合格后持證上崗。
分析前質控
◎ELISA原理：1971年Engvall等人把免疫組化的EIA技術應用于臨床檢驗發展為ELISA技術。
特點 ：在固相表面組裝免疫活性物質形成"免疫吸附劑"
酶標記免疫活性物質，進行信號放大；
有二步溫育反應二次洗滌過程；
靈敏度特異性相對較高。
局限性：只能檢測到ng水平
精密度差（批內CV15-20%）；
線性范圍窄（一個數量級）；
存在"HD-HOOK"效應。
ELISA原理
●根據檢測目的和操作步驟不同有三種基本方法。
●雙抗體（原）夾心法 檢測抗原（體）的常見方法，應用針對抗原兩個不同決定族的兩種單抗分別作為固相載體和酶標抗體檢測溶液中的抗原（適用于二價以上抗原,不能測 小分子半抗原）。
●間接法 檢測抗體的方法，利用酶標記的抗抗體（第二抗體）檢測已與固相抗原結合的抗體。
●競爭法 檢測抗原或小分子半抗原、抗體，以測抗原為例，使待測抗原和酶標抗原競爭與固相抗體結合，結果如待測抗原含量越多，與固相抗體結合的酶標抗原就越少，顯色越淺，二者呈負相關。
ELISA原理
今后的發展方向
●聚苯乙烯表面的高級制備。已有的技術是酰肼化（聚二氟乙叉，PVDF）；生物素化；預包被多聚賴氨酸等，均是***產品。
●酶促信號放大的改變，如酶促熒光、酶促化學發光等。
ELISA臨床意義
●各型肝炎的特征及標志物
乙肝二對半的模式及臨床意義
HBsAg HBeAg HBcAb-IgG HBcAg-IgM HBeAb HBsAb 臨床意義
+ + - - - - 急性HBV感染早期HBV復制活躍
+ + + + - - 急慢性HBV感染，HBV復制活躍
+ - + + - - 急慢性HBV感染，HBV復制中躍
+ - + + + - 急慢性HBV感染，HBV復制低躍
+ - + - + - HBV復制停止或極低
- - + + - - 平靜的HBV攜帶狀態，HbsAg
- - + - - - HBV既往感染，未產生抗-HBs
- - + + + - 抗HBs出現前期，HBV復制低
- - + - + + HBV感染恢復期
- - + - - + HBV感染恢復期
+ + + + - + 不同亞型ＨＢＶ再感染
+ - - - - - ＨＢＶ－ＤＮＡ整合
- - - - - ＋ 病后或接種疫苗后獲得免疫
試劑盒選擇
◎衛生部規定乙肝試劑，丙肝試劑，艾滋病試劑，梅毒試劑及血型試劑必須使用經衛生部生物制品檢定所檢定合格，并貼有防偽標簽的產品，試劑應從靈敏度，特異性，精密度，穩定性，簡便性，安全性及經濟性作出全面的評價。
◎靈敏度：有二層含義，1）為試劑檢出被檢物質的最低量的能力；2）為試劑對人群或大量樣品中陽性檢出的能力（假陰性越少越好），取決于包被物的全面性。
◎特異性：指試劑正確檢定不存在的被檢物質的能力（無假陽性），取決于包被抗原（體）及標記抗原（體）的純度及特異性。
◎精密度：ELISA試劑一般指其批內CV，其值應小于15%；定量試劑應同時考察線性范圍
試劑盒選擇
◎穩定性：試劑在規定條件下能儲存的時間，一般采用破壞性試驗即將試劑存放于37℃保存，定期測定其靈敏度，特異性和精密度等指標，直到其質量指標開始下降為止，通常認為37℃每穩定一天相當于4-10℃保存一個半月。
◎簡便性：指在不影響試劑的前三項指標的前題下，實驗和測定步驟越少越好，在定性試驗中結果判斷簡單明了，）定量試驗結果計算也應簡單。
◎安全性：指試劑對操作者和環境安全無害無傳染性。
◎經濟性：試劑在同等質量條件下通過大規模生產或技術進步降低成本而市場價格比較合理。
試劑盒選擇
◎試劑評價需要有權威的血清考核盤（Panel）進行檢測，一般實驗室不易從生檢所或臨檢中心取得，每進一次試劑評價一次也很麻煩。可以通過間接的信息對試劑進行選擇。
◎根據該試劑生檢所批批檢定報告，了解其質量水平，按照質量計劃選擇靈敏度高的或特異性高的試劑；
◎通過詢問試劑包被物的組成，如原料來源（基因工程或合成多***），片段的組合（按比例混合或化學合成），片段的長短等判斷試劑的優劣；
◎參考室間質評評價報告中對試劑的評價結果，這比較客觀公正，因為統計數字均來自各參評醫院，反映了試劑在某一地區的使用情況；
◎根據權威部門發布的試劑評價結果，了解市場上試劑的質量優劣。
儀器質控
為使儀器保持最佳工作狀態應建立維護和校正儀器的標準操作程序（SOP），所要控制的儀器包括移液器（加樣槍），水浴箱（溫箱），洗板機和酶標儀。
◎移液器：ELISA加樣量小（5-100ｕl），其準確性直接影響實驗結果，利用稱重法檢查：吸取刻度指示量的水，萬分之一天平稱重后計算吸量是否準確，一般應在±10%以內；
◎水浴箱 經常檢查水浴箱溫度計所示的溫度和水中（或溫箱內）實測溫度是否一致，允許有±1℃的誤差；
◎洗板機 每個廠家設置洗板后的殘留液有各自的規定一般不超過2ul ，人工扣板時，墊紙不濕，定期檢查管孔是否堵塞；
◎酶標儀 經常維護其光學部分，防止濾光片霉變，定期檢測校正，使其保持良好的工作性能。
附1：酶標儀校正程序
◎濾光片波長精度檢查：將不同波長的濾光片從酶標儀上卸下，用UV-2201型紫外-可見分光光度計（波長精度±0.3nm）于可見光區對每個濾光片進行掃描，其檢測值與標定值之差為濾光片波長精度。
◎通噵差與孔間差檢測：通道差檢測是取一只酶標板小孔杯（杯底須光滑，透明，無污染以酶標板架作載體， 將其（內含200ul甲基橙溶液吸光度調至0.500A左右）置于8個通道的相應位置，蒸溜水調零，1于490nm處連續測三次,觀察其不同通道的檢測器測量結果的一致性，可用極差值來表示。孔間差的測量是選擇同一廠家，同一批號酶標2板條（8條共96孔）分別加入200ul甲基橙溶液（吸光度調至0.100A左右）先后置于同一通道，蒸溜水調零,于490nm處檢測，其誤差大小用±1.96s衡量。
n 零點飄移（穩定性觀察）：取8只小孔杯分別置于8個通道的相應位置，均加入200ul蒸溜水并調零，于490nm處每隔30分鐘測一次，觀察各個通道4小時內吸光度的變化。
附1：酶標儀校正程序
◎精密度評價：每個通道3只小杯分別加入200ul高中低3種不同．濃度的甲基橙溶解，蒸溜水調零，于490nm作雙份平行測定，每日測二次（上下午各一次），連續測定20天。分別計算其批內精密度，日內批精密度,日間精密度和總精密度及相應的CV值。
◎線性測定：用電子天平精確稱取甲基橙配制5個系列的溶液，于490nm平行測8次，取其均值。計算其回歸方程，相關系數及標準估計誤差s，并用±1.96s表示樣品測量的誤差范圍.雙波長測定評價：取一分甲基橙溶液，分別加入3種不同濃度的溶血液（測定波長為490nm，校正波長為585nm），先后于8個通道檢測，每個通道測3次，51比較各組之間是否具有統計學差異，以考察雙波長消除干擾組分的效果。
◎一般酶標儀無585nm濾光片，可選用550nm或630nm濾光片。450nm 濾光片的檢定選用普魯蘭溶液（校正波長為630nm）
常見酶標儀評價
標本的采集和保存
◎可用作ELISA的標本十分廣泛，體液（如血清，血漿，各種積液），分泌物（如唾液）和排瀉物（如糞便，尿液）均可作為標本以測定其中的抗原或抗體成分，一般使用血清。
n 標本采集時應盡量避免溶血，因紅細胞破裂可釋放過氧化物酶活性物質干擾立可讀方法的結果，可造成假陽性；長菌的標本同樣的道理易產生假陽性。
◎抗凝不完全的標本因纖維蛋白元的干擾而造成假陽性，建議盡量不用抗凝血尤其是用肝素抗凝劑。
◎標本在冰箱中保存時間過長易導致血清IgG聚合，使間接法的試劑本底加深，一般血清置4℃冰箱5天內完成測試。如需保存一周以上則要-20℃冰凍保存，融解時應上下顛倒充分混勻，同時避免氣泡。
◎ELISA的靈敏度>1ng/ml水平上,標本間的污染要盡量避免，尤其不應與生化試驗用同一管標本.最起碼應先做免疫后做生化.
附：內外干擾物質的影響分析
溶血 脂濁 RF 自身抗體 AFP 補體 肝素 EDTA
A 0.165 0.200 0.250 0.264 0.186 0.146 0.183 0.126
S 0.023 0.016 0.007 0.029 0. 010 0. 007 0.019 0.013
A對照0.151 0.195 0.195 0.195 0 .116 0.116 0.116 0.116
S 0.038 0.008 0. 008 0.008 0.018 0.018 0.018 0.018
P > 0.05 > 0.05 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 <0.01 <0.01
分析中質控
◎ELISA實驗的結果受操作影響很大，每個步驟包括加樣，溫育，洗滌，顯色，酶標儀讀數均應認真負責才能充分發揮ELISA的高靈敏，強特異的優點。
◎因此,應建立實驗項目的標準操作程序（SOP）。
加樣
◎加樣應用微量移液器（加樣槍）按規定的量加入微孔板的1/3處避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產生氣泡。
◎每次加樣應更換吸嘴，做到一人一吸頭，以免發生交叉污染;干吸頭預先在血清中抽吸三次。
◎樣本稀釋，目的是為了減少非特異性反應，所以一定要先加稀釋液后加樣本，特別注意加樣后要在微量振蕩器上振蕩30秒鐘，同時注意防止液體溢出。如后面操作步驟中加二種以上試劑時均需振蕩混勻。
◎如用滴瓶滴加試劑應先將滴瓶搖勻并擠去第一滴有氣泡的試劑后加樣。
溫育
◎抗原抗體反應需要在一定溫度下（37°C），經過一定的時間才能達到反應的平衡點
◎ELISA邊緣效應是由溫育形成的。所以溫育一般采用能 使反應液溫度迅速達到平衡的水浴法。一種放在水浴箱的隔板上，另一種是放在溫箱的濕盒里。水要浸至板條的1/3處，不可將板條疊加放置。
◎邊緣效應（2ng/mlHBsAg一步法三種不同溫育法的結果）
洗滌
◎ELISA是靠洗滌來達到分離結合與未結合抗原抗體復合物及酶標記物的目的，同時洗滌也可將非特異吸附的蛋白質的干擾以及血球、細菌中的酶干擾清除掉。
◎手工洗滌一般采用浸泡方法：1）甩去孔內反應液；
2）用洗滌液過洗一遍（即注滿孔后即甩去）；
3）微孔重新注滿洗液后浸泡2-3分鐘，間歇搖動；
4）甩去孔內液體，拍板，用紙吸干。
重復以上操作至少5次。注意各種試劑盒的洗滌液盡量不要混用。
◎洗板機洗板一定要預先把板架放平，使洗板機上的每個放液和吸液纖孔都能一致地插入孔底，將孔內液體全部吸干，同時要設置一定的浸泡時間。如出現機洗后拍板有較多殘留液時應再用手工洗2次以上。關機前要用蒸溜水沖洗管道，避免堵孔。
顯色
◎HRP催化底物的一步呈色反應，同樣需要一定的時間和溫度，
◎ 一定要按照說明書規定的時間溫度（一般為37°C，10-15分鐘）恒定反應后終止
◎或根據臨界值質控血清吸光度值達0.2左右使的時間而恒定反應時間.
酶標儀判讀結果
◎顯色反應終止后應立刻比色（30分鐘內）。
常見的顯色系統有OPD和TMB二種，以后者最為常見，而TMB酸不易終止因此必須盡快比色以免影響結果。OPD終止后顯棕色，測定波長為490nm；
TMB終止后顯黃色，測定波長為450nm，
二種底物的校正波長均用630nm。
使用雙波長的優點可以消除反應板條上的劃痕手印的干擾。同時要注意反應板應用紙吸干后才能置酶標儀中比色，否則吸光度易出現負值或損壞濾光片。
報告方式
◎定性試驗 國內外為便于統一計算，一律按S/C.O方式報告，S為標本A值，C.O即Cut Off值（陽性判定值）
◎夾心法和間接法以S/C.O≥1為陽性；
竟爭法與中和法以S/C.O﹤1為陽性
◎Cut Off的計算公式以試劑盒說明書的為準常見的有：
◎A） C.O=2.1×N（當N不足0.05時按0.05計），
◎此公式由P/N>2.1換算而來，常用于夾心法。
◎B） C.O=0.5×N，從抑止率公式換算而來，
◎常用于竟爭，中和法
◎C） C.O=N+C（C為常數），用于間接法。
◎D） C.O=C×P+N（C為常數），用于間接法。此公式最客觀，但對生產廠家要求很高，陰陽性對照測定值要基本恒定。
報告方式
定量分析 用已知量的標準品作一系列稀釋，ELISA測定，繪制標準曲線，結果以絕對量或單位表示。
ELISA的標準曲線每次都要和待測標本做在同一塊板上。
◎現有的ELISA定量試劑盒標準曲線只有在較窄的濃度范圍內成直線，要得到精確的結果實屬不易。
因此嚴禁用定性試劑盒做定量分析。
灰區概念
把定量分析的正常值范圍引入定性分析建立灰區概念，即將CO值上下的一段區域定為陽性可疑，需重復實驗或換試劑重測以確定其陰陽性，如仍落在灰區范圍內則報告+（陽性）。
灰區概念對血站系統的獻血員篩查尤為重要。
灰區的設置有二種：
1）C.O×（1±CV），
CV為該試劑的批內CV （一般在15-20%間）；
2）C.O±2s，s為實驗室做室內質控ROC的s。
高值鉤鐮效應（HD-HOOK）
◎在二位點夾心ELISA中，其劑量反應曲線的高劑量（HIGH DOSE，HD）區段，線性走向不是呈平臺狀無限后延，而是向下彎曲狀，似一只鉤子或一把鐮刀（HOOK），MILES（1974） 根據此現象寫實性地稱之為"HD-HOOK"效應。產生該現象的分子機理有"分子變構說"和"濃度效應"等推論。
◎一步法和二步法均存在， 只是前者出現的更早些，大多數是高值低吸光度，很少陰性結果。
高值鉤鐮效應（HD-HOOK）
質量控制
（Quality Control，QC）
◎英國Whitehead教授建議生化檢驗工作的質量控制分為4個步驟：最佳條件的變異（OCV）；常規條件的變異（RCV）；病人結果的統計（SPR）；室間質量控制（EQA）。前三個步驟即室內質量控制（IQC）。
◎在GLP概念里QC即指IQC，其定義為：由實驗室工作人員采取一定的方法和步驟，連續評價本室工作的可靠性，旨在監測和控制本室常規工作的精密度，提高批內批間樣本檢驗的一致性，以確定檢驗報告是否可靠或可否發出的一項工作。
◎免疫測定方法的靈敏度和特異性要比生化方法高得多，因此QC手段不能照搬生化模式。分為定性和定量二個方面。
質量控制
（Quality Control，QC）
定性試驗：ELISA定性試驗的臨床意義在于是否檢出病原體，與檢出量無關，因此QC要保證試驗的靈敏度和特異性。生化的質控圖方法僅能觀察靈敏度而無法監控特異性。
建議使用臨界值血清界定法：將試劑盒所設的陰陽性對照作為內對照指示反應；另設臨界值、高值質控血清，正常人血清作為外對照，與標本同時檢測，臨界值S/C.O≥1，高值質控血清S/C.O≥10，正常人血清A值在0.05~0.07之間。
◎陽性質控血清失控（臨界值為靈敏度，高值為"HOOK"效應監控）應重做陰性標本；陰性對照失控應重做陽性標本。
◎以表格式記錄每塊板的外對照實驗結果，作為QC資料存檔。
質量控制（Quality Control）
◎定量試驗：ELISA定量試驗常見于腫瘤因子（如AFP，CEA，CA系列），激素類，免疫球蛋白類，這些物質在體內有一定的量（正常范圍），超出這個量才呈病理情況，故需定量測定。定量試驗的質控方法可參考生化方式。
質量控制（Quality Control）
"即刻性"質控：在開始進行質控時，只需要有3個質控血清測定值即可進行質控。當這組數據擴大到20次有效值時就可以計算RCV的X，s。方法：
（1）先將測定值從小到大排列，X1最小，Xn最大；
◎（2）計算X和s；
◎（3）計算SI上限值和下限值。
◎SI上=（X最小-X）/S， SI下=（X最大-X）/S
◎對照SI表，檢查是否出控，
SI上、下限≤規定值，在控；
SI上或下限>規定值，失控。
質量控制（Quality Control）
SI值表（即刻性質控）
N 3 4 5 6 7 8 9 10 11
N（3s） 1.15 1.49 1.75 1.94 2.10 2.22 2.32 2.41 2.48
N （2s）1.15 1.46 1.67 1.82 1.94 2.03 2.11 2.18 2.23
12 13 14 15 16 17 18 19 20
2.55 2.61 2.66 2.71 2.75 2.79 2.82 2.85 2.88
2.29 2.33 2.37 2.41 2.44 2.47 2.50 2.53 2.56
室內質控血清的制備：
◎收集陽性血清（無明顯溶血、黃膽、脂肪血和污染血清,到一定量（夠本室使用3-6個月的量）；
◎傳染性病毒陽性需經56℃、10小時滅活后使用；
◎過濾，除纖維沉淀物；
◎稀釋，用正常人血清或10%小牛血清PBS溶液稀釋；
◎測定值，與定值參考品進行對比、求值，一般定在Cut Off值附近的陽性值；
◎分裝小瓶（每日用量），加蓋、貼簽，-20℃凍存備用。
不使用質控血清的室內質控
◎操作過程的質量控制（分析前、后質控）
◎試劑盒陰陽性對照或標準濃度系列。
陰對≤0.05 陽對-陰對>0.8 標準濃度落在2s
陽對 > 0.80 ; 范圍內
◎病人資料統計，連續觀察病人檢測結果的資料，并分析該病人其他化驗結果的關系。
質量保證
（Quality Aprovment，QA）
◎質量保證的核心內容是室間質評。室間質評是一種回顧性評價，主要控制試驗結果的準確性，也是某些定量試驗量值朔源。
評價方法
◎1） 發質控物進行調查，這是目前國內外常見的形式，采用定期發放質控物至各實驗室，各實驗室在規定的日期進行檢驗，并將結果報至組織者（部、省臨檢中心）。組織者通過統計分析，再將評價結果寄回實驗室，使其了解工作質量，發現問題，提高質量。其缺點為由于各實驗室吃小灶或互相打電話修改結果而達不到真正評價作用。
◎2） 現場調查，事先不通知，臨時派出人員到各實驗室，規定采用常規方法，檢測一組標本，進行評價。這種方法可以解決實際問題，進行現場指導，組織者常因人力、物力的原因而不能經常性進行。
成績計算方法
◎定性試驗：檢驗結果與預期結果一致，得100分，錯誤不得分，總計實驗室的得分。從全部參評單位的得分中求出該批質控物平均分（X）和標準差（s），再通過公式計算出每一個實驗室的得分比值（SI）
SI=（實驗室得分-平均分X）/平均標準差（s）
SI在0.0-0.9間為良好,1.0-1.9間為優秀,SI為負值時數值越大成績越差。
◎定量試驗
SI=（實驗室測定值-預期值X）/預期值的標準差s SI越小，表明越靠近靶值，成績越好。
0-1.0為優秀,1.1-2.0為良好,>2.0為差。SI無正負之分
質量改進
（Quality Improvement，QI）
◎質量改進的建議來源于三方面：
◎（1）室內質控：提示實驗的精密度差，應規范各項操作；
◎（2）室間質評：提示實驗的準確性差，應改進設備的準備或更換試劑；
◎（3）病人或醫生的報怨：提示實驗的偶然誤差，應分析實驗的質控過程是否達標。
記錄
◎所有實驗的原始資料均應存檔； 所有的記錄均應規范登記在冊； 原始登記表應記錄試劑來源、批號；質控血清的來源及測定值并注明是否在控；簽上實驗者姓名及審核者姓名。
◎如試驗結果對臨床診斷有決定意義，其樣本應保留，至少與病歷保存期一致。 |
