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ELISA技術(shù)的質(zhì)量控制
概述
Engvall和Perlmann于1971年首先建立了酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）。隨著科技的發(fā)展，ELISA在抗原、抗體、酶、固相載體及包被技術(shù)等方面都有較大的進(jìn)步，其靈敏度和特異性均大大提高。由于該技術(shù)具有簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)，因而已被廣泛應(yīng)用于各行業(yè)。盡管如此，ELISA在應(yīng)用過(guò)程中仍然存在著許多難點(diǎn)，必須嚴(yán)格控制才能保證檢測(cè)的質(zhì)量。
ELISA質(zhì)量保證是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，許多重要的環(huán)節(jié)都影響到檢測(cè)的質(zhì)量。現(xiàn)分述如下：
一、方法學(xué)的影響
ELISA測(cè)定模式包括以下幾種：雙抗體夾心法、間接法、雙抗原夾心法、IgM抗體捕捉法、競(jìng)爭(zhēng)抑制法，其中競(jìng)爭(zhēng)抑制法因受操作時(shí)差所引起的不公平競(jìng)爭(zhēng)等因素的影響，結(jié)果重復(fù)性較差，質(zhì)量較難控制。
二、試劑因素
1.試劑的選擇
免疫檢測(cè)的原理均基于抗原抗體反應(yīng)。由于該反應(yīng)過(guò)程受多種因素的影響，如普遍存在基質(zhì)效應(yīng)、交叉反應(yīng)等，因而檢測(cè)結(jié)果難以溯源，不同方法、不同試劑之間甚至同一試劑不同批號(hào)間結(jié)果均缺乏可比性。試劑質(zhì)量在很大程度上決定了檢測(cè)的水平，因此在引入新項(xiàng)目之前必須對(duì)試劑進(jìn)行嚴(yán)格的評(píng)估。試劑的評(píng)估有以下幾個(gè)步驟：⑴確定開展該項(xiàng)目的必要性；⑵了解該項(xiàng)目現(xiàn)有的檢測(cè)方法和原理；⑶在了解試劑的組成基礎(chǔ)上選擇多家試劑盒進(jìn)行比較，判斷標(biāo)準(zhǔn)首選參考方法或參考物質(zhì)，其次為臨床的滿意度及權(quán)威機(jī)構(gòu)的報(bào)告如各級(jí)室間質(zhì)量評(píng)價(jià)、CDC報(bào)告等；⑷定期對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行追蹤反饋直至最終認(rèn)可該試劑。
2.試劑的準(zhǔn)備
不同批次的ELISA試劑在制作過(guò)程中很難保證質(zhì)量完全一致，即使是通過(guò)批批檢的項(xiàng)目其檢測(cè)結(jié)果也存在差異，因此必須選擇和訂購(gòu)長(zhǎng)批號(hào)的試劑，并保證保存條件。嚴(yán)格執(zhí)行這一標(biāo)準(zhǔn)可以避免因試劑批號(hào)改變而重新建立質(zhì)控體系及重新評(píng)估試劑的復(fù)雜過(guò)程，并且能夠保證結(jié)果的穩(wěn)定性；對(duì)于效期短、使用率低的試劑，應(yīng)當(dāng)小量分裝，每次使用則取分裝部分即可，避免反復(fù)凍融造成試劑的失效。
試劑使用前必須平衡至室溫，否則會(huì)影響檢測(cè)下限。未用完的室內(nèi)質(zhì)控品及本次不需使用的試劑應(yīng)密封并及時(shí)放回冰箱保存。
三、樣本因素
標(biāo)本干擾因素包括內(nèi)源性干擾因素和外源性干擾因素，前者包括類風(fēng)濕因子、補(bǔ)體、異嗜性抗體、自身抗體、溶菌酶等，后者包括標(biāo)本溶血、標(biāo)本被細(xì)菌污染、標(biāo)本貯存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、標(biāo)本凝固不全、冷凍標(biāo)本的反復(fù)凍融等。其中外源性干擾因素是我們?cè)跈z測(cè)過(guò)程中可以避免也是必須避免的因素，而避免內(nèi)源性因素的干擾則主要通過(guò)選擇合適的試劑盒。在臨床中遇到少見的疑難病例時(shí)應(yīng)當(dāng)考慮到內(nèi)源性干擾因素的存在。以下對(duì)外源性干擾因素進(jìn)行簡(jiǎn)要說(shuō)明：
1.標(biāo)本溶血 要注意避免出現(xiàn)嚴(yán)重溶血。血紅蛋白中含有血紅素基團(tuán)，其具有類過(guò)氧化物的活性，因此，在以辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）為標(biāo)記酶的ELISA測(cè)定中，如果血清標(biāo)本中血紅蛋白濃度較高，則其就很容易在溫育過(guò)程中吸附于固相，從而與后面加入的底物反應(yīng)顯色。
2.標(biāo)本被細(xì)菌污染 標(biāo)本的采集及血清分離要注意盡量避免細(xì)菌污染。細(xì)菌菌體中除可能含有內(nèi)源酶對(duì)測(cè)定產(chǎn)生非特異性干擾外，還可能對(duì)抗原抗體等蛋白產(chǎn)生分解作用。另外標(biāo)本在保存中出現(xiàn)渾濁或絮狀物時(shí)，應(yīng)離心沉淀后取上清檢測(cè)。
3.標(biāo)本貯存時(shí)間過(guò)長(zhǎng) 標(biāo)本在低溫下保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，IgG可聚合成多聚體，在間接法ELISA測(cè)定中會(huì)導(dǎo)致本底加深、甚至出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。通常情況下血清標(biāo)本可在2～8℃下保存l周，冷凍保存時(shí)間會(huì)更長(zhǎng)，但對(duì)于抗體或抗原含量低的標(biāo)本而言，則可能會(huì)因抗體掉價(jià)、抗原分解而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。
4.標(biāo)本凝固不全 血液通常在采集后半小時(shí)后開始凝固，18～24h完全凝固。如果在血液未凝固時(shí)即離心分離血清，則可因纖維蛋白原非特異吸附于微孔而造成假陽(yáng)性結(jié)果。為了縮短標(biāo)本處理時(shí)間，可以在離心前將血液標(biāo)本置于溫箱中溫育或者采用帶分離膠的采血管或于采血管中加入適當(dāng)?shù)拇倌齽┮约铀傺宓姆蛛x。
5.冷凍保存標(biāo)本避免反復(fù)凍融 標(biāo)本的反復(fù)凍融會(huì)因其所產(chǎn)生的機(jī)械剪切力對(duì)標(biāo)本中的蛋白等分子產(chǎn)生破壞作用，使抗體效價(jià)跌落從而引起假陰性結(jié)果，所以測(cè)抗體的血清標(biāo)本如需保存作多次檢測(cè)，宜少量分裝凍存。此外，標(biāo)本在凍存時(shí)會(huì)因蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，因此重新融解的標(biāo)本必須混勻，但不要進(jìn)行劇烈振蕩，反復(fù)顛倒即可。
四、操作因素對(duì)ELISA結(jié)果的影響
ELISA測(cè)定一般遵循以下步驟：固相包被→加樣品→溫育→洗滌→加酶結(jié)合物→溫育→洗滌→加底物→溫育→顯色→終止顯色→比色
目前各種形式的ELISA自動(dòng)分析儀已經(jīng)進(jìn)入市場(chǎng)，如廣泛應(yīng)用于血站系統(tǒng)的微板式全自動(dòng)酶免分析儀，其試劑為開放式的，而對(duì)于其它類型的儀器，則試劑和儀器往往是配套的。但當(dāng)前大部分醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室均采用手工操作加儀器測(cè)定的方式。ELISA操作步驟復(fù)雜，操作不當(dāng)將引起較大的誤差。以下敘述各個(gè)步驟中的影響因素。
1.加樣
加樣器是一種比較精密的工具，其在長(zhǎng)時(shí)間使用時(shí)會(huì)因機(jī)械磨損或者推動(dòng)桿內(nèi)附著血痂等原因造成加樣不準(zhǔn)，尤其是對(duì)于樣本量較大的臨床實(shí)驗(yàn)室，因此必須定期對(duì)加液器進(jìn)行維護(hù)和校準(zhǔn)。每次加不同的標(biāo)本時(shí)均需更換吸嘴，以免發(fā)生交叉污染。加樣時(shí)速度不可太快，避免將標(biāo)本加在孔壁上部 ，并注意不要濺出或產(chǎn)生氣泡。加樣時(shí)還應(yīng)當(dāng)注意操作時(shí)差對(duì)結(jié)果的影響，操作時(shí)差是指加入標(biāo)本、試劑及混勻時(shí)間的差異。操作時(shí)差在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中都存在，尤其是手工操作，日常檢測(cè)標(biāo)本多達(dá)幾百個(gè)，從加入第一個(gè)標(biāo)本到最后一個(gè)標(biāo)本，需幾十分鐘，加入試劑及混勻等均存在著前后的時(shí)間差異，使抗原抗體反應(yīng)和酶促反應(yīng)時(shí)間不一致，操作時(shí)差對(duì)競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)的結(jié)果影響更大，在加酶結(jié)合物和底物時(shí)可用定量多道加液器，使加液過(guò)程迅速完成。如果使用滴瓶除注意滴加的角度外還要注意滴加的速度，速度太快，容易出現(xiàn)重復(fù)滴加或者加在兩孔之間，造成非特異性吸附。另外有些項(xiàng)目在檢測(cè)前需要稀釋以減低非特異性反應(yīng)，但稀釋的方式非常重要，如果采用手工稀釋則容易因操作者個(gè)體差異而產(chǎn)生不一致的結(jié)果，尤其是吸光度處于臨界值附近的標(biāo)本，因此最佳的方式是采用振蕩器混勻。
2.溫育
在 ELISA檢測(cè)中一般有兩次抗原抗體反應(yīng)，即加標(biāo)本和加酶結(jié)合物后。抗原抗體反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時(shí)間，這一保溫過(guò)程稱為溫 育(incubation)。
溫育常采用的溫度有 43℃、37℃、室溫和4℃（冰箱溫度）等。37℃是實(shí)驗(yàn)室中常用的溫育溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的最適反應(yīng)溫度。有實(shí)驗(yàn)表明，抗原抗體反應(yīng)一般在37℃經(jīng)1～2小時(shí)產(chǎn)物的生成可達(dá)頂峰。為加速反應(yīng)，可在一定范圍內(nèi)提高反應(yīng)的溫度并在反應(yīng)過(guò)程中連續(xù)振蕩以增加抗原抗體接觸的機(jī)會(huì)。抗原抗體反應(yīng)在4℃反應(yīng)更為徹底，形成的產(chǎn)物更多更穩(wěn)定，但因所需時(shí)間太長(zhǎng)，在ELISA檢測(cè)中一般不予采用。
溫育的方式有溫箱法、微波輻射法、水浴法等，其中水浴法能較好解決因受熱不均衡所致的周圍孔與中央孔結(jié)果的吸光度差異（這種現(xiàn)象被稱為“邊緣效應(yīng)”）。若用溫箱溫育則ELISA板應(yīng)放在濕盒內(nèi)，濕盒要選用傳熱性良好的材料如金屬等，在盒底墊濕的紗布，最后將ELISA板放在濕紗布上。采用這種溫育方式的關(guān)鍵是必須保證濕盒內(nèi)的溫度達(dá)到反應(yīng)的要求，可在反應(yīng)前將濕盒預(yù)溫至規(guī)定的溫度，并用溫度計(jì)監(jiān)測(cè)反應(yīng)過(guò)程。采用水浴時(shí)，將ELISA板置于水浴箱中，板底貼著水面。為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋或用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，此時(shí)可讓反應(yīng)板漂浮在水面上。溫育過(guò)程中，反應(yīng)板不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。嚴(yán)謹(jǐn)?shù)腅LISA試劑盒一般都規(guī)定了明確的溫育溫度，若要求室溫溫育，則一般是指20～25℃。微波輻射法能縮短溫育時(shí)間，但不能解決“邊緣效應(yīng)”，因而較少使用。
3.洗滌
洗滌是ELISA測(cè)定過(guò)程中決定實(shí)驗(yàn)成敗的一個(gè)關(guān)鍵步驟。其目的是去除反應(yīng)體系中與反應(yīng)無(wú)關(guān)的成分、未結(jié)合的酶結(jié)合物以及反應(yīng)過(guò)程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。由于抗原和抗體的包被通常是在堿性條件下與固相的疏水鍵相互作用而被動(dòng)吸附于其上的，因此必須注意非離子去垢劑的使用濃度，最常用的洗滌液是含0.05％吐溫20的0.02mol/L， pH 為7.4的 PBS液，如果洗滌液中的吐溫20超過(guò) 0.2％，可使包被于固相上的抗原或抗體解吸附而影響實(shí)驗(yàn)的測(cè)定下限。
洗滌可采用洗板機(jī)或手工洗滌兩種方式，手工洗板則分為浸泡式和流水沖洗式洗滌。無(wú)論洗板方式如何，在向板孔內(nèi)注液時(shí)應(yīng)當(dāng)避免氣泡殘留孔內(nèi)，否則會(huì)因洗滌液難以進(jìn)入孔中而影響洗滌效果。在采用洗板機(jī)洗板時(shí)，一定要將板條平放于板架上，保證洗板機(jī)上的每個(gè)吸液針都能一致地插入板孔底部將洗液完全吸凈，否則空白值將升高甚至出現(xiàn)“花板”現(xiàn)象（背景不干凈），造成實(shí)驗(yàn)失敗，尤其是當(dāng)酶結(jié)合物非特異吸附而殘留于板孔時(shí)。若采用手工洗板，則可在每次棄去板孔內(nèi)液體后將反應(yīng)板于布料上拍干，布料可在消毒洗滌后重復(fù)使用。
手工洗板一般為3～5次，使用洗板機(jī)洗板時(shí)，其所需次數(shù)可通過(guò)以下實(shí)驗(yàn)確定：選擇8×12 HBsAg ELISA包被板條，在每孔中平行加入相同的一份弱陽(yáng)性血清，按試劑盒說(shuō)明加入酶結(jié)合物并完成溫育，洗板機(jī)設(shè)置如下：第1次洗滌1排、第2次洗滌2排、第3次洗滌3排……直至8次洗滌8排，每次只洗滌1遍，其結(jié)果是第1排洗滌了8遍，第2排洗滌7遍……第8排洗滌1遍，加底物顯色后，根據(jù)吸光度值不再改變的反應(yīng)條的洗滌次數(shù)來(lái)確定最佳的洗板次數(shù)，例如第3排反應(yīng)條吸光度值不再改變，則認(rèn)為該項(xiàng)目最佳洗滌條件為6遍。另外有三方面必須注意：一是在使用洗板機(jī)洗板時(shí)，通常在上機(jī)前應(yīng)先將反應(yīng)液棄去并用流水快速?zèng)_洗1遍，避免因反應(yīng)液對(duì)洗板機(jī)管道污染而造成的交叉污染和背景顏色加深，但對(duì)于粘性大的稀釋液或反應(yīng)液而言，則需直接上機(jī)洗滌，并增加洗板后清水沖洗管路的次數(shù)；二是對(duì)于兩步法而言第一步洗滌次數(shù)不宜太多，否則將降低結(jié)果的吸光度值。
4.顯色
顯色是 ELISA中的最后一步溫育反應(yīng)，在以HRP作為標(biāo)記酶的ELISA試劑盒中，主要采用TMB和OPD兩種底物，其中以TMB最為多見，TMB底物顯色一般要求室溫或37℃反應(yīng)15～30分鐘。研究表明，顯色受時(shí)間和溫度的影響，一般37℃反應(yīng)30分鐘可使顯色充分，如果縮短反應(yīng)時(shí)間或者降低反應(yīng)溫度均可影響檢測(cè)的下限。為了保證結(jié)果的穩(wěn)定性，必須固定顯色時(shí)間和溫度，但不少操作者往往忽略了這一點(diǎn)。TMB顯色體系的A液和B液可在使用前先混合然后用排槍加入反應(yīng)孔中，這樣既節(jié)省人力又縮短了操作時(shí)差對(duì)結(jié)果的影響。反應(yīng)液應(yīng)新鮮配制并且避免接觸金屬器皿，否則可因氧化等原因產(chǎn)生顏色反應(yīng)。OPD由于其具有致癌性目前已很少使用。
5.比色
ELISA顯色的結(jié)果必須通過(guò)酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)，有兩個(gè)重要的原因：一是不同的個(gè)體的色覺存在差異，如果僅憑肉眼判斷，則結(jié)果重復(fù)性差，并且難以形成統(tǒng)一的判斷標(biāo)準(zhǔn)，尤其是對(duì)于HBeAb、HBcAb這樣的檢測(cè)項(xiàng)目；二是日益頻繁的醫(yī)療糾紛要求臨床實(shí)驗(yàn)室必須對(duì)ELISA檢測(cè)的原始吸光度值，陰陽(yáng)性判斷結(jié)果等原始數(shù)據(jù)進(jìn)行保存，否則面對(duì)醫(yī)療糾紛時(shí)將無(wú)法舉證。
TMB的終止液有多種，疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉（SDS）等酶抑制劑均可使反應(yīng)終止，各類酸性終止液則將藍(lán)色轉(zhuǎn)變成黃色。有實(shí)驗(yàn)表明，從終止反應(yīng)后2分鐘開始，樣本的吸光度值逐漸下降，起始吸光度值越高其下降速度越快，為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性，宜在終止反應(yīng)后2分鐘內(nèi)讀取吸光度值。
酶標(biāo)儀應(yīng)采用雙波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定，必須包括對(duì)顏色產(chǎn)物敏感和不敏感的兩個(gè)吸收峰波長(zhǎng)，在非敏感波長(zhǎng)處測(cè)定特異性顯色的吸光度值接近為零，此時(shí)測(cè)的吸光度值為容器上的劃痕、指印、背景等造成的光干擾。以TMB底物為例，其最大吸收的波長(zhǎng)為450nm，非敏感波長(zhǎng)為630nm，雙波長(zhǎng)檢測(cè)最終得到的吸光度值為兩者之差。雙波長(zhǎng)測(cè)定能去除背景的干擾，一般不設(shè)空白孔，否則會(huì)出現(xiàn)吸光度值為負(fù)值的現(xiàn)象。
酶標(biāo)儀的使用需強(qiáng)調(diào)儀器的維護(hù)和保養(yǎng)，酶標(biāo)儀首先應(yīng)放置通風(fēng)處，避免機(jī)器內(nèi)部尤其是濾光片發(fā)霉，在使用過(guò)程中避免酸等物質(zhì)溢出腐蝕儀器，每半年或一年請(qǐng)計(jì)量局對(duì)酶標(biāo)儀進(jìn)行檢定，并請(qǐng)廠商定期維護(hù)。比色前應(yīng)先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體。酶標(biāo)儀在使用前應(yīng)先預(yù)熱15～30分鐘，測(cè)讀結(jié)果會(huì)更穩(wěn)定。
五、灰區(qū)的設(shè)置
通常情況下，ELISA定性實(shí)驗(yàn)以“陽(yáng)性”和“陰性”來(lái)報(bào)告結(jié)果，兩者間有一條分界線被稱為“陽(yáng)性判斷值”（cut-off value，CO值），這是定性免疫測(cè)定結(jié)果報(bào)告的依據(jù)。由于ELISA CO值的設(shè)置不能區(qū)分所有正常和異常的人群，尤其是位于CO值附近的人群，并且ELISA檢測(cè)具有以下幾個(gè)特點(diǎn)：檢測(cè)變異大（18%～65%）；不同試劑盒CO值存在差異；病毒感染存在窗口期；病毒變異后表達(dá)產(chǎn)物含量低以及個(gè)體差異等，因此在CO值附近存在一個(gè)臨床意義可疑的的區(qū)域被稱之為“灰區(qū)”，在國(guó)內(nèi)的傳染性病原體抗原和抗體檢測(cè)的ELISA試劑盒中均未涉及“灰區(qū)”的設(shè)置，但僅僅依靠CO值來(lái)決定感染的有無(wú)，尤其是對(duì)獻(xiàn)血員的篩查具有較大的風(fēng)險(xiǎn)。因此對(duì)于檢測(cè)結(jié)果位于“灰區(qū)”的病人可采用確認(rèn)實(shí)驗(yàn)或追蹤檢測(cè)的辦法加以確診。
目前“灰區(qū)”的設(shè)置有二種方式：⑴CO×（1±CV）， CV為該試劑的批內(nèi)CV (一般在15-20%)；⑵CO±2s，s為實(shí)驗(yàn)室做室內(nèi)質(zhì)控ROC（常規(guī)條件下的變異）的標(biāo)準(zhǔn)差。
六、標(biāo)本復(fù)查
ELISA手工檢測(cè)過(guò)程復(fù)雜，影響因素較多，即使室內(nèi)質(zhì)控在控，也可能因孔間差異而造成結(jié)果的差異，因此加大復(fù)查力度是保證結(jié)果準(zhǔn)確性的可靠方法，比如對(duì)HBsAg、HBeAg、HCV-Ab、HIV-Ab、TP-Ab等項(xiàng)目的可疑、弱陽(yáng)性標(biāo)本及少見模式的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行復(fù)查。
復(fù)查方式主要有兩種：一是采用同一種試劑復(fù)查，理由是市售試劑均通過(guò)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局（SFDA）認(rèn)可，嚴(yán)格按照其說(shuō)明書操作，檢測(cè)結(jié)果具有法律效應(yīng)，若使用不同的試劑（非確證試驗(yàn)）復(fù)查，當(dāng)結(jié)果不相符合時(shí)，則最終結(jié)果難以判斷（免疫檢測(cè)缺乏“金標(biāo)準(zhǔn)”）。另一種復(fù)查方式是采用國(guó)外進(jìn)口試劑進(jìn)行復(fù)查，其理由是盡管進(jìn)口試劑并不是“金標(biāo)準(zhǔn)”，但實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)對(duì)此高度重視，并且使用了質(zhì)量較好，價(jià)格較貴的試劑，但該法對(duì)于小醫(yī)院而言則很難實(shí)施。
七、結(jié)果判斷和報(bào)告
常用下列幾種方法表示結(jié)果：
1.定性測(cè)定
(1)陽(yáng)性判定值法(cut-off value，CO)：一般為陰性對(duì)照的平均A值加一個(gè)常數(shù)，試劑制備、檢測(cè)過(guò)程必須嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)化，要先計(jì)算出陽(yáng)性對(duì)照A值平均數(shù)和陰性對(duì)照A值平均數(shù)。標(biāo)本A值≥陽(yáng)性判定值為陽(yáng)性。陽(yáng)性判定值公式中的常數(shù)是在特定的檢測(cè)系統(tǒng)中通過(guò)對(duì)大量標(biāo)本的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)而得到的。現(xiàn)以HIV檢測(cè)試劑盒為例。NC=陰性質(zhì)控對(duì)照的A值；PC1=抗-HIV-1陽(yáng)性質(zhì)控對(duì)照的A值；PC2=抗-HIV-2陽(yáng)性質(zhì)控對(duì)照的A值；NC值的要求：⑴NC必須小于0.250。去掉大于等于0.250的陰性質(zhì)控對(duì)照。⑵計(jì)算留下的陰性質(zhì)控對(duì)照的平均值（NCx）。⑶NC必須在0.6NCx和1.4NCx之間。去掉NC小于0.6NCx和大于1.4NCx的陰性質(zhì)控對(duì)照。實(shí)驗(yàn)滿足下列條件有效：⑴多于半數(shù)的陰性質(zhì)控對(duì)照符合要求（一般為1個(gè)PC，3個(gè)NC）；⑵PC1-NCx≥0.400；⑶PC2-NCx≥0.400(如果使用)。如果實(shí)驗(yàn)有效，CO=NCx+0.100,樣品A值大于等于CO，判定為有活性反應(yīng)。樣品A值小于CO，判定為無(wú)活性反應(yīng)。根據(jù)以上敘述可以看出，在這種方法中陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照也起到了質(zhì)控的作用，試劑變質(zhì)和操作不當(dāng)均會(huì)產(chǎn)生“實(shí)驗(yàn)無(wú)效”的后果。由此可以看出為了避免檢測(cè)結(jié)果受單孔陽(yáng)性或者陰性對(duì)照的影響（當(dāng)參與CO計(jì)算時(shí)），必須設(shè)立多孔對(duì)照、合理布局，并限定取舍條件。
(2)S/C（待測(cè)標(biāo)本A值／校準(zhǔn)品A值）：S/C≥1.1為陽(yáng)性，S/C＜0.8為陰性；S/C≥0.8但＜1.1為可疑，反應(yīng)體系中陽(yáng)性、陰性對(duì)照及校準(zhǔn)品檢測(cè)的吸光度必須落在規(guī)定的范圍內(nèi)，結(jié)果才有效。
(3)S/N值法(待測(cè)標(biāo)本A值／陰性對(duì)照A值)或S／Co值法：通常S／N≥2．1 ，S／Co≥1為陽(yáng)性。
(4)抑制率法：在競(jìng)爭(zhēng)抑制法中結(jié)果可用抑制率表示。抑制率（％）＝（陰性對(duì)照A值-標(biāo)本A值）/陰性對(duì)照A值×100%，一般以抑制率≥50%為陽(yáng)性。
2.半定量測(cè)定 結(jié)果一般以滴度表示。將標(biāo)本連續(xù)稀釋后，進(jìn)行ELISA檢測(cè)，在陽(yáng)性臨界值以上的最高稀釋度即為該標(biāo)本的“滴度”。
3.定量測(cè)定 即用已知量的標(biāo)準(zhǔn)品作一系列稀釋后進(jìn)行ELISA測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果以絕對(duì)量或單位表示。在ELISA定量檢測(cè)中每一塊反應(yīng)板都必須繪制相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
4.結(jié)果報(bào)告
傳統(tǒng)的ELISA結(jié)果只報(bào)告“陽(yáng)性”或者“陰性”，但不能解決“灰區(qū)”的問題，因此引入“可疑”的報(bào)告方式是比較合理和科學(xué)的，同時(shí)對(duì)結(jié)果做必要的說(shuō)明，如“結(jié)果已經(jīng)復(fù)查，建議定期復(fù)查或定量檢測(cè)”；對(duì)于HBeAb、HBcAb檢測(cè)，由于各試劑盒CO值差異及變異系數(shù)大等因素，結(jié)果缺乏可比性，位于CO值附近的標(biāo)本復(fù)查結(jié)果陰陽(yáng)性只是概率事件，另外HBcAb存在原倍和1：30檢測(cè)模式及定量檢測(cè)模式，報(bào)告結(jié)果的不一致對(duì)于臨床實(shí)驗(yàn)室來(lái)說(shuō)是不可回避，也是目前醫(yī)療糾紛主要集中點(diǎn)和“結(jié)果互認(rèn)”的最大障礙，因此在減小室內(nèi)變異的同時(shí)必須引入陽(yáng)性和弱陽(yáng)性的報(bào)告方式。
八、原始記錄
ELISA檢測(cè)結(jié)果變異大，不同體系難以溯源，因結(jié)果不一致而引起的醫(yī)療糾紛逐日增多，因此ELISA檢測(cè)的原始存根必須完整而全面地保存，包括布局，原始吸光度值，檢測(cè)的陰陽(yáng)結(jié)果，檢測(cè)者，試劑廠家，批號(hào)，質(zhì)控品來(lái)源及批號(hào)等。嚴(yán)禁人為修改檢測(cè)結(jié)果。
九、質(zhì)量控制
1.室內(nèi)質(zhì)量控制（室內(nèi)質(zhì)控）
ELISA定性試驗(yàn)的臨床意義在于是否檢出病原體，與檢出量無(wú)關(guān)，因此質(zhì)量控制（quality control, QC）要保證試驗(yàn)的靈敏度和重復(fù)性。目前定性實(shí)驗(yàn)的質(zhì)控規(guī)則還還存在爭(zhēng)議，目前有以下幾種比較流行的理論：
⑴室內(nèi)質(zhì)控品
室內(nèi)質(zhì)控品的穩(wěn)定以及合適的濃度是運(yùn)用一切質(zhì)控規(guī)則的前提。可選擇S/CO值減去精密度測(cè)定中得到的三倍批間CV%（通常的ELISA測(cè)定批間變異（CV%）在15%左右）與該S/CO值的乘積（意即三倍SD）仍大于1的質(zhì)控血清作監(jiān)測(cè)重復(fù)性的室內(nèi)質(zhì)控品用。 計(jì)算公式：S/CO（1-3CV%）=S/CO-3SD。同時(shí)選擇S/CO處于1.5左右的質(zhì)控血清以判斷每次測(cè)定時(shí)試劑盒測(cè)定下限的有效性。
⑵ “即刻性”質(zhì)控
一些實(shí)驗(yàn)室不是每天進(jìn)行ELISA項(xiàng)目的檢驗(yàn)，而ELSIA部分試劑盒效期短 ，用同一批號(hào)試劑盒連續(xù)常規(guī)測(cè)20次，難度較大。采用"即刻法"質(zhì)控統(tǒng)計(jì)方法，只需連續(xù)測(cè)3次，即可對(duì)第3次檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行質(zhì)控。①先將測(cè)定值從小到大排列，X1最小，Xn最大 ；②計(jì)算X和s；③計(jì)算SI上限值和下限值。SI上=（X最小-X）/S，SI下=（X最大-X）/S；④對(duì)照SI表，檢查是否出控。SI上、下限≤規(guī)定值，在控； SI上或下限>規(guī)定值，失控。
⑶Levey-Jennings質(zhì)控圖結(jié)合Westgard多規(guī)則質(zhì)控方法 Levey-Jennings質(zhì)控圖以及Westgard多規(guī)則質(zhì)控方法最早應(yīng)用于生化檢測(cè)的質(zhì)量控制，在ELISA檢測(cè)中仍為探索階段，一般認(rèn)為：①一 次超出3SD；②連續(xù)二次超出2SD；③3～5次連續(xù)處于一側(cè)的2SD之內(nèi)；④5～7次連續(xù)偏向橫軸的一側(cè)，均為失控。目前多采用一次超過(guò)2SD作為“告警”，一次超出3SD為“失控”。
另外還有Westgard多規(guī)則質(zhì)控規(guī)則、累積和（CUSUM）質(zhì)控規(guī)則等質(zhì)控方法。
⑷衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心確定的質(zhì)控方法：
室內(nèi)質(zhì)控品：定性測(cè)定的室內(nèi)質(zhì)控品，除了試劑盒附帶的陰陽(yáng)性對(duì)照外，實(shí)驗(yàn)室還應(yīng)該選擇至少2個(gè)室內(nèi)質(zhì)控品，其中一個(gè)為弱陽(yáng)性質(zhì)控品，接近Cutoff值，S/Co值應(yīng)該為2～4之間；另一個(gè)為陰性質(zhì)控品。定量測(cè)定則至少要求一個(gè)水平的質(zhì)控品。
測(cè)定頻度：每臺(tái)儀器，每次檢測(cè)患者樣本時(shí)至少測(cè)定一次室內(nèi)質(zhì)控品；ELISA測(cè)定每塊板都要測(cè)定室內(nèi)質(zhì)控品。
質(zhì)控圖繪制：定性測(cè)定可采用弱陽(yáng)性質(zhì)控品的S/Co值作質(zhì)控圖。定量測(cè)定參照臨床化學(xué)的繪制方法。質(zhì)控判斷規(guī)則：定性測(cè)定為弱陽(yáng)性的質(zhì)控品不能測(cè)定為陰性；陰性質(zhì)控品不能測(cè)定為陽(yáng)性。重復(fù)性的判斷規(guī)則為12S（警告限），13S為失控限。定量測(cè)定參照臨床化學(xué)的判斷規(guī)則。
⑸室內(nèi)質(zhì)控的現(xiàn)狀及應(yīng)對(duì)措施
免疫質(zhì)控品制作困難，不管是自制血清或者購(gòu)于其它機(jī)構(gòu)，其穩(wěn)定性和濃度很難達(dá)到要求，加之ELISA影響因素較多，失控后很難找到確切的原因。因此如何開展ELISA室內(nèi)質(zhì)控一直困擾著臨床檢測(cè)者。基于此，不同實(shí)驗(yàn)室采取了不同的應(yīng)對(duì)措施，舉例如下：①選擇衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心（NCCL）的低值質(zhì)控血清作為室內(nèi)質(zhì)控品，儲(chǔ)備量以3個(gè)月，采用一次超過(guò)2SD作為“告警”，一次超出3SD為“失控”的質(zhì)控規(guī)則，（但該法對(duì)于HBeAb（4NCU/ml）、 HBcAb(2NCU/ml)檢測(cè)不適用，因?yàn)榧词官|(zhì)控在控，其結(jié)果也可能為陰性）；②由于質(zhì)控品不穩(wěn)定，每個(gè)月需重新設(shè)立靶值 ，并根據(jù)常規(guī)CV設(shè)定SD（SD= ×CV¯）；③陰陽(yáng)性對(duì)照正常，室內(nèi)弱陽(yáng)性和陰性質(zhì)控正常，且沒有出現(xiàn)“花板”（洗板不干凈，背景顏色深）的情況下認(rèn)為該檢測(cè)批有效，但仍需對(duì)位于“灰區(qū)”和弱陽(yáng)性的HBsAg、HBeAg結(jié)果及少見模式結(jié)果進(jìn)行復(fù)查，避免偶然因素及孔間差對(duì)結(jié)果造成影響；④若陰陽(yáng)性對(duì)照、陰性質(zhì)控異常，或出現(xiàn)“花板”的情況則必須整批復(fù)查；⑤在陰陽(yáng)性對(duì)照、陰性質(zhì)控正常且未出現(xiàn)“花板”的情況下，弱陽(yáng)性質(zhì)控S/Co超出-3SD時(shí)復(fù)查位于“灰區(qū)”標(biāo)本，超出+3SD時(shí)則復(fù)查弱陽(yáng)性標(biāo)本；⑥對(duì)于抗體檢測(cè)，尤其是競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)HBeAb、HbcAb，由于不同試劑盒、不同檢測(cè)方法間CO值存在差異及變異系數(shù)大等因素，結(jié)果缺乏可比性，失控后的處理很難滿意地解決，在沒有統(tǒng)一的判斷標(biāo)準(zhǔn)、較小的變異系數(shù)及明確的臨床意義的情況下，引入弱陽(yáng)性報(bào)告方式在臨床實(shí)踐中證明可行；⑦室內(nèi)質(zhì)控的評(píng)價(jià)：認(rèn)真分析每一次室內(nèi)質(zhì)控失控的原因，并對(duì)各項(xiàng)檢測(cè)的均值，CV等進(jìn)行月與月之間的比較分析，及時(shí)發(fā)現(xiàn)試劑盒檢出能力的變化及操作中存在的問題，并采取適當(dāng)?shù)拇胧﹣?lái)提高檢測(cè)的精準(zhǔn)性。
2.室間質(zhì)量評(píng)價(jià)（室間質(zhì)評(píng)）
室間質(zhì)評(píng)是一種回顧性評(píng)價(jià)，主要是控制實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，也是某些定量實(shí)驗(yàn)量值的溯源。作為臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)積極參與各級(jí)室間質(zhì)評(píng)計(jì)劃，其要點(diǎn)是保證同病人標(biāo)本一樣對(duì)待室間質(zhì)評(píng)物。必須強(qiáng)調(diào)的是室間質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果必須同室內(nèi)質(zhì)控一并分析，查找原因以期改進(jìn)工作中的不足，同時(shí)指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室選擇合適的試劑盒。
十、免疫檢驗(yàn)存在的問題
HBV基因組變異對(duì)病毒HBsAg和HBeAg測(cè)定影響問題，以及如何評(píng)價(jià)試劑盒對(duì)這些變異株的檢測(cè)效能；HBcAb檢測(cè)在保證輸血安全中的意義；HBeAb、HBcAb溯源性問題；HBcAb檢測(cè)模式的問題等均困擾著臨床檢測(cè)者。
[1] 李金明. 臨床酶免疫測(cè)定技術(shù). 第1版. 北京：人民軍醫(yī)出版社，2005：87-105.
[2] 沈霞. 臨床免疫學(xué)與免疫學(xué)檢驗(yàn)新技術(shù). 第1版. 北京：人民軍醫(yī)出版社，2002：12-19.
[3] 陶義訓(xùn).免疫學(xué)和免疫學(xué)檢驗(yàn).第二版.北京：人民衛(wèi)生出版社，1999：140.
[4] 李金明. 乙型肝炎病毒血清標(biāo)志物測(cè)定及結(jié)果解釋的若干問題. 中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2006，29（5）：385-389.
[5] 衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心，中國(guó)醫(yī)院協(xié)會(huì)臨床檢驗(yàn)管理專業(yè)委員會(huì). 《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床實(shí)驗(yàn)室管理辦法》及配套文件，2006：10-11.
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