一．ELISA試驗有效性與三項對照
什么是“有效性”（Validity）？要獲得準確的檢測結果“有效性”評價，就會關系到：為什么要設置“陰性、陽性和空白”等不可缺少的三項對照？要用什么樣的物質擔當“陰性、陽性和空白對照（品）”？這“三項對照”如何設置、需要設置幾個孔位？獲得的測定值如何“認可、取舍與計算”？隨后，又如何依照陽性對照均值（PCx）與陰性對照均值（NCx）的差值（P-N，或N-P）大小做出“試驗結果有效性”的最終裁決呢？…等等，這一連串的問題，在國外“正規”品牌的ELISA試劑《使用說明書》中都有明細和詳盡的說明。既有理論要點提示，又有具體細致的舉例解說。很可惜，在90年前后，國內興起ELISA檢測熱潮之際，在一片“國外試劑說明書太詳細、太復雜、不容易看明白、…”等等“一片埋冤”聲中，正好迎合國內商家的“意愿”。從此以后，國產ELISA試劑的說明書，越來越簡單。這其中商家就有兩個“好處”：好處之一，用A4、或B5，甚至比B5還要小的一張紙，代替國際試劑的好幾頁的“使用說明書”（等同于一份“操作手冊”），每年就可節省一大筆印刷成本費；好處之二，如同國際試劑說明書上向用戶交待的各種表明本試劑質量有關的詳盡內容，國產試劑的所謂“說明書”上統統可以“刪除、回避、拒絕”向用戶通報和承諾。我90年前后收集的<美>雅培、<法>巴斯德、<荷>阿克蘇等相關試劑的原文說明書，幾經搬動全都處理，很是可惜。近日，杭州檢疫局朋友送了一份生物梅里埃中國有限公司的中文版《人類免疫缺陷病毒抗原抗體診斷試劑盒（酶聯免疫法）使用說明書》。對照閱讀之下，深深感到這才是一份真正意義上的《使用說明書》呀！在我下文提到的若干“概念、問題”，從中都可以找到答案。我現在參照我本人1993年的《肝炎ELISA試劑質量與檢測結果有效性評價》會議講稿相關內容，就“三項對照與檢測結果有效性”表示如下認識和討論。
二．三項對照要求與用途
ELISA檢測，按照試劑說明書要求，每次試驗、每塊扳上都要設置以下3項對照和用途：
1．空白對照：僅用稀釋液代替檢測樣本、用以觀測最終反應的顯色“本底”、并用于酶標儀消除、扣除“本底”，即：以本底為“零”讀取陽性、陰性對照孔和樣本檢測孔的吸光值（A）；或者，在計算陰性對照均值（NCx）、陽性對照均值（PCx）、樣本讀數的S/C.O.值時減去空白對照的本底吸光值。早年的酶標儀無自動扣除空白對照孔讀數功能，這種酶標議現已淘汰不用了，寫上這段話的意思是補充說明設置空白對照的用途。空白孔具體如何讀取讀數，則依照說明書操作。例如，生物梅里埃中國有限公司的中文版《人類免疫缺陷病毒抗原抗體診斷試劑盒（酶聯免疫法）使用說明書》上提示：以空氣讀空白（不放板架和板條），在450nm（單波長）、或450nm和620—700mn（底物是TMB）參考波長進行讀數。
2．陰性對照（品）：
（1）陰性對照（品）的概念與要求：所謂陰性對照（品），應當是本項檢測試驗中采用與待撿物（樣品、人用試劑就是人的血清等）具有同源性和同質性，又不含有待檢物質，并能客觀比較和鑒別處理因素（血清免疫學試驗中有特異性抗原與抗體反應）之間的差異。因此，用動物血清或其制品（如牛血清白蛋白等）代替陰性人血清作為對照品，從理論和實踐上都是不可取的，弊端甚多，無須細述。注意：據我所知，國產ELISA試劑中，有的廠牌是用動物血清制品稀釋配置、或與部分人血清混合配置的；其二，陰性對照讀數，并非是“越低越好”。NCx值接近0.00X水平，這是假象！試想一下，真正采用“陰性人血清”的陰性對照品，NCx值會如此之低嗎？舉個例子，雅培乙肝六項EIA試劑的NCx值，分別為：0.010（HBsAg）、0.027（抗—HBs）、0.035（HBeAg）、1.083（抗—HBe）、1.065（抗—HBc）、0.045（抗HBc-IgM）。生物梅里埃的HIV試劑NCx是0.091。辨別試劑NCx值是否合理的一個很簡單的方法，只要對比大量陰性樣本的實際讀數就“一目了然”啦！
一個題外插曲：表明ELISA試劑內在質量的一個重要統計標志，就是要看：陰性樣本的的上限不應當大于、必須小于C.O.I.=1.00；反之，陽性樣本的的下限不可小于、應當大于C.O.I.=1.00！早年我用SPSS軟件輸出阿克蘇HIV和國產甲、乙試劑檢測600例左右的健康人體檢血清的三幅直方圖，可以表明陰性樣本的不同分布特征，頗有意思。
我為什么要如此細說NCx呢？因為NCx值在Cut off值計算中是相當舉足輕重的（詳后）。
（2）陰性對照（品）分為兩類
一是代表受檢人血清中并不含有、或方法學靈敏度未能檢出的待檢物的基準水平，并且是結果判斷值（Cut off）計算式中決定“是”（陽性）、或“否”（陰性）的唯一可變值。陰性對照值高，導致假陰性；反之，導致假陽性。如：HBsAg、HBeAg、抗—HBc等。二是陰性對照設置，在方法學上要求加入指示性定量標準品，如中和劑HBeAg，定量HBcAg等，用以檢測抗—HBe、抗—HBc。或者，選取代表平均水平的正常人血清用作陰性對照，如檢測抗—HBc IgM。此類Cut off 值計算時，多數均包括陰性和陽性對照值2個可變值。
3．陽性對照（品）：
（1）陽性對照（品）的概念與要求：同陰性對照（品），只是采用“精選”的含有待檢物質的人血清制備而成。所謂“精選”，就是把收集的陽性人血清經過數種試驗進行“篩試”、把含有“干擾性物質”的血清剔除、不用，以避免出現“假陽性”干擾試驗結果。
（2）陽性對照（品）設置，也可區分為兩種類型與用途：
一是陽性對照主要用于評價該項試驗結果是否有效和試驗結果的穩定性與可比性。而所設的陽性對照的測量值不列入Cut off值計算、但是不可不做。如HBsAg、抗—HBs、HBeAg等。
二是陽性對照的設置，不僅用于評價試驗結果是否有效和試驗結果的穩定性與可比性，而且計入Cut off的計算。此時的Cut off值的含義是代表該標志物在健康（正常）人群中正常值范圍的上限。待檢樣本檢測值超過該上限（Cut off）時表示有診斷意義。例如抗—HBe、抗—HBc、抗—HBc IgM等。
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三．陰性與陽性對照平均值計算與判斷
1．陰性對照平均值NCx有效性計算判斷舉例：
（1）第一類NCx計算與評價：以HBsAg為例
Ⅰ. 設置3孔的NCx計算：NCx=（0.011+0.010+0.090）/3=0.010
Ⅱ. 任一個NC值應≤0.100至≥－0.010；
Ⅲ. 各NC值也應介于≥0.5×NCx至≤1.5×NCx之間。此時各孔的NC值均處于NCx±0.006范圍內，其中遇有一孔NC值偏離該范圍時，則棄去該NC值，再計算NCx。如有2孔NC值超出該范圍時，本次試驗（無效）應予復試。
Ⅳ. 不同廠牌對NCx的具體要求略有不同，但總的原則幾為一致，如<法>巴斯德HBsAg EIA Kit。
（2）第二類NCx計算與評價：可包括抗—HBc、抗—HBe。以抗—HBc、抗—HBe為例：
Ⅰ. 取3孔陰性對照A值的平均值：
抗—HBc NCx=（1.027+0.989+1.278）/3=1.065
抗—HBe NCx=（1.169+1.088+0.993）/3=1.083；
請各位注意：這2個NCx是不是很接近1.00呀？也就是說，十分接近C.O.I.（C.O./S，或C.O./A）=1.00！這不是一種偶然，而是國際試劑（如雅培）的“質量”標志。如果偏大，例如1.50以上，或者偏小，0.50以下，待檢樣本中會導致出現什么現象呢？請讀者自己思考吧。
Ⅱ. 各孔NC值均應＜2.000，并處于≥0.5×NCx至≤1.5×NCx之間。若其中1孔NC值偏離該范圍時，棄去，再計算2孔的NC值的NCx。如有2孔NC值偏離該范圍時，應重新試驗。
2．陽性對照平均值PCx有效性計算與評價也分為兩類：
（1）第一類 PCx計算與評價：以HBsAg為例 DauI*sZmR
Ⅰ. 第一類PCx的計算不列入Cut off計算，可取（設）2—3孔陽性對照的平均值PCx（Abbott）： PCx=（1.024+1.030）/2=1.027。注意：本例雅培試劑HBsAg的Cutoff值=NCx+0.05=0.06，PCx 的S/C.O.=1.027/0.06=17.12。如果S/C.O.超過20.00以上，提示HBsAg陽性對照含量太高！
Ⅱ. 參照方法學的要求，也可規定PCx應≥1.000（指A值），而且各孔PC值要求≥0.5×PCx 至≤1.5×PCx
Ⅲ. PC的設置及PCx的計算，主要用于評價本次試驗結果是否有效和各批/次試驗結果的穩定性和可比性，并不參與Cut off值的計算。同一個批號試劑及其陽性對照品在規定保存條件和有效期內，各次試驗時PCx值也應保持相對穩定水平。換句話說，實驗結果有效性評價時，也應觀測陽性對照的“統計過程控制”（SPC）處于穩定狀態—輸出“控制圖”。
（2）第二類PCx的計算與評價：也以抗—HBc為例
Ⅰ. 可取（設）2—3孔PC 的A值得平均值PCx： PCx=（0.051+0.038）/2=0.045
Ⅱ. 參照方法學要求，也可規定各孔PC值應處于≥0.5×PCx 至≤1.5×PCx范圍內。
Ⅲ. PCx值參與Cut off值的計算，例如抗—HBc的Cut off（Abbott）：
Cut off=0.4（NCx）+0.6（PCx）。
該值（Cut off）可以理解為：指示性定量HBcAg反應值的40%加定量抗—HBc反應值的60%之和，恰為健康人群血中抗—HBc正常值范圍的界限。任一待檢樣本的檢出值低于該Cut off值時則判為抗—HBc陽性，大于該Cut off值時則判為抗—HBc陰性。
3．計算NCx、PCx有效性與統計控制應用
讀者如果注意到NCx與PCx有效性計算規則，很有點像電視上的“去掉一個最小值、去掉一個最大值”的評分辦法，就知道統計學上的異常值“粗略”取舍法，把3個對照值中的1個最小、或最大“異常值”剔除，再重新計算余下的2個對照值的平均值。這樣，不但可以比較前、后試驗的各次反應板之間的NCx與PCx的波動狀態，用這樣的NCx、PCx去繪制控制圖，也可以減少因為含有異常值的平均值造成的“假失控”機率。況且，無論是單值控制圖、或是均值控制圖，質控數據中是不應當含有“異常值”數據的。
4．ELISA試驗統計控制如何借鑒PCx有效性計算與應用，擬在另文中討論。
四．計算P-N與N-P差值的意義用途
1．國際品牌的EIA試劑，很注重觀測陽性與陰性（P-N）、或陰性與陽性（N-P）對照均值之間的差值，以及P/N（或N/P）比值與C.O.I.指數的比較，并把它視為：在評價試劑質量或判斷試驗結果有效性時是不可或缺的評價指標。我用雅培的EIA乙肝試劑為例列表如下（見附表4—1）：
附表4—1 HBsAg（a、b、d法）抗—HBsHBeAg抗—HBe抗—HBc抗—HBc-IgM
CutoffNCx+0.05NCx+0.05NCx+0.060.5(NCx)+0.5(PCx)0.4(NCx)+0.6(PCx) 0.25(PCx)+NCx
P-N或N-P≥0.400≥0.300≥0.300≥0.300≥0.300≥0.300
1.027-0.010=1.0171.447-0.027=1.4201.202-0.035=1.1671.083-0.040=1.0431.065-0.0481.0170.846-0.045=0.801
P/N（或N/P）與A/C.O.（或C.O./A）比較
P/N=1.027/0.01=102.7A/C.O.=1.027/0.06=17.121.447/0.027=53.591.447/0.077=18.791.167/0.2533.341.167/0.095=12.28N/P=1.083/0.040=27.08C.O./A=0.562/0.01=14.051.065/0.045=23.670.453/0.045=10.07P/N=0.846/0.045=18.8A/C.O.=0.846/0.257=3.29
例如：HBsAg的P-N要求≥0.400（A、B、C法），其它各項試劑要求＞0.400或0.300。P-N或N-P意義是：如果小于0.400或0.300，需考慮試驗操作有誤；如復試后仍小于0.400或0.300，則考慮試劑失效。
同樣說法，用P/N或N/P比值與C.O.I.指數的比較，也是提供實驗者觀測實驗結果是否有效、可否成立的參考水平。
—敬請注意，國內有的EIA試劑配套提供的陽性（PC）或陰性（NC）對照物含量過高，達到、甚至超過部臨檢中心臨床高值血清的含量。此時，不能參與上述的N-P、或P-N的標準進行評價。
2．可以反過來提問：國際品牌試劑說明書就如此可靠、可信嗎？我的答復是：實際用過國際品牌試劑后，您就會獲得如下感受和觀點：如此詳細的試劑使用說明書，就相當于一份相當完整的質量保證指導書，正如<生物梅里埃中國有限公司的中文版《人類免疫缺陷病毒抗原抗體診斷試劑盒（酶聯免疫法）使用說明書》>中所鄭重聲明的：14 性能特點當按照說明書正確操作、結合適當的檢測儀器以及相關附件或者生物梅里埃公司的設備時，生物梅里埃公司保證這個體外診斷試劑正確的實驗性能。請大家體會一下，國際品牌試劑竟有如此膽量、敢于公開做出如此的書面承諾，靠的是什么？就是當前的一句名言：靠品牌意識、靠ISO的質量管理和保證。
至于說明書中提供的計算舉例（附表4—2），包括：NCx=0.091，清除異常的質控對照，確定PC1-NCx≥0.600、PC2-NCx≥0.600、PC3-NCx≥0.400，計算界限值（Cut off）等等，其引用的具體數據，不是臆造、不是寫著好看的，而是參照正常的實驗數據舉例演算、可供用戶參考對比的。如果您的實驗數據與附表4—2中舉例的數據相差太大、太離譜，它可以提示您“多加思考、找找原因”。如果有網友也在用生物梅里埃公司的HIV試劑，不妨用您的實驗數據對照一下，是不是這個情況，向大家說說。
3．如果再注意說明書上的其它信息，例如說明書中的表2、3、4、5都是很值得細看和推敲的：/ *; （1）HIV—抗體陽性樣品診斷敏感性：不僅是3個100%，而且更要注意它的陽性樣本的數量是445、200和303份（附表4—3），這可是頗為可觀的樣本數量哦！如果該公司選用的抗體陽性樣本是按照WHO的要求預先已經用蛋白印跡法確認為HIV—1、2、型抗體和抗原陽性血清，那么，附表4—2敏感性的3個100%是很有“高度”指導價值的。
附表4—3 抗體陽性樣品的診斷敏感性
樣本數量敏感性
445份HIV—1抗體陽性標本100%
200份HIV—2抗體陽性標本100%
303分HIV抗原陽性100%
（2）再看分析特異性附表4—4提示多達4796例的獻血員標本特異性竟然有99.9%！如果是按照WHO的要求，可參考Bull.WHO.70(6)：751-，1992；72（1）：129-，1994，這4796例獻血員標本事前經過蛋白印跡法確認是HIV陰性樣本的話，那么，附表4—3的3個100%，才是真正的頂級國際水平，實在令人驚喜。再看附表4—5列舉人血清中對于ELISA檢測會產生“非特異性干擾”的9種物質（成份）檢測全部“陰性”的結果，也很有臨床參考價值。這2幅附表提供如此重要的敏感性和特異性的數據信息，在國產試劑說明書中是難以查悉的。
五．陽性與陰性灰帶
此處所指陽性與陰性灰帶率%，既是試劑本身的質量評價指標，也是判斷待檢樣本中是否有需要重復復檢的可疑樣本范圍（Sample Retest Range），及各批/次試驗時可疑樣本占有率。例如雅培EIA乙肝試劑的陽性與陰性灰帶%要求如下：HBsAg定為0.0%，意思是：不應當有陽性或陰性“灰帶”樣本；其余各項目都是10.0%。這又是一個負責任的對試劑質量標準的公開承諾！
這兒說的“灰帶”，就是：待檢樣本判為“可疑”的S/C.O.=1.00＋/－10%的范圍、該樣本需要復檢。
六．筆者附注：.
筆者一點感想：我90年開始接觸ELISA，當時詳細講解ELISA的書籍并不多。隨后的數年中，借助應用過幾個品牌進口試劑的機會，從反復閱讀原版試劑說明書中逐漸地悟出了有關EIA試劑質量的一些“理解與心得”。這些“理解與心得”，從當時的國產試劑說明書上是難以查詢獲得的。我寫這一段話，意思是希望朋友們，是否找一篇國際上標準的EIA試劑使用說明書細細地讀一讀，比如生物梅里埃中國有限公司的中文版《人類免疫缺陷病毒抗原抗體診斷試劑盒（酶聯免疫法）使用說明書》，并與國產ELISA試劑說明書對比著看看，我想大家一定會有不同的感受。
本篇文章來源于 檢驗在線 http://www.labbbs.com
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