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抗生素治療導致細菌內毒素釋放的研究進展
中華外科雜志 1998年第0期第36卷 綜述
作者：李晉 彭毅志 肖光夏 吳其林
單位：610083 成都，成都軍區總醫院燒傷科(李晉、吳其林)；重慶第三軍醫大學西南醫院燒傷研究所(彭毅志、肖光夏)
由革藍陰性(Gˉ）細菌引起的各種感染仍是目前臨床上主要的并發癥和死亡原因之一。即使在應用各種廣譜、高效抗生素治療感染取得巨大進步的今天，對抗菌治療中產生的一系列嚴重反應，如發熱、中毒性休克及多器官功能衰竭（MOF）等，仍然沒有取得防治的根本性進展。其中抗生素治療中導致G細菌釋放內毒素（lipoplysaccharide，LPS），以及由其引起的嚴重損害存在著十分復雜的作用機理沒有完全闡明，是一個主要原因［1］。梅毒患者用汞劑治療后可出現發熱等癥狀加劇的反應，稱為雅-赫二氏反應（Jarish-Herxheimer raction）。自五十年代以來，在抗生素治療的患者中，因Gˉ細菌裂解釋放出大量LPS造成臨床癥狀惡化的證據，先后在布魯氏菌、腦膜炎雙球菌和Gˉ細菌腸膿毒癥的患者中得到證實。自那以后，大量的實驗證實，抗生素治療中可以引起Gˉ細菌LPS釋放，作用于單核巨噬細胞介導多種炎癥因子釋放，如：TNF-α、白細胞介素（IL）-1、IL-6、IL-8、前列腺素、凝血素、干擾素、血小板基激活因子等。這些因子適量時可激活免疫系統，產生殺滅微生物的有益作用。過量時可引起機體嚴重病理生理反應，表現為發熱、低血壓、心動過速、休克、MOF及死亡［6，7］。醫學抗生素分冊，1996,17：192-195.
一、LPS及其作用原理
1．LPS結構特點：LPS為Gˉ細菌外膜中的脂多糖成分。它由三部分組成：（1）O-特異性側鏈；（2）核心多糖；（3）類脂A。O-特異鏈由20～40個重復單位組成，每個重復單位由3～7個糖分子組成。它是細菌表面的主要抗原，決定型的特異性。核心多糖可分為連接O-特異鏈的外核部分和連接類脂A的內核部分。核心多糖相對穩定，同一菌屬結構相同。內核部分含有庚糖和2-酮基-3-脫氧辛酸（KDO）兩種特殊的糖類分子。它們在LPS結構中起著連結多糖與類脂的作用。類脂A由2個葡萄糖脂、磷酸鹽和一定量的脂肪酸組成，為LPS分子中最穩定的部分；各類Gˉ細菌均相同，它是LPS的主要毒性成分。目前認為在LPS中只有類脂A和KDO具有毒性。LPS的共同抗原在類脂A/KDO區，常被O-特異鏈遮蓋而處于隱蔽狀態［2，3］。
2．LPS與結合蛋白（lipopolysaccharide binding protein，LBP）、糖蛋白CD14：LBS為血清中一種糖蛋白，分子量為60000U，在肝細胞合成。LBP對各類細菌的類脂A均具有高度親和力，能與LPS結合形成LPS-LBP復合物，促進LPS與單核巨噬細胞上的CD14結合。正常情況下含量較低，在應激狀態下其含量可明顯增加。CD14是一種分子量為55000 U的糖蛋白，借助磷酸酰肌醇聚糖錨吸附于單核巨噬細胞膜表面，為LPS-LBP復合物的受體。當LPS-LBP復合物與CD14結合后，激活有關酶系統，促進單核巨噬細胞合成、分泌多種細胞因子，如：TNF-α、IL-1、IL-6等，TNF-α被公認為引起內毒素休克、MOF等炎癥反應的主要因子。目前認為LPS的毒性作用，主要是通過LBP和CD14這一途徑實現的。因為LPS-LBP復合物誘導巨噬細胞產生TNF-α的能力是單一LPS的1000倍［4，5］。
3．LPS釋放與炎癥反應:早在一個世紀前，Jarish和Herxheimer就發現
二、不同種類抗生素影響Gˉ細菌LPS釋放的主要機理
1．抑制蛋白質合成類抗生素與LPS釋放:氨基糖甙類、氯霉素類和喹諾酮類抗生素能夠抑制細菌蛋白質的合成，導致生長停止、增殖減慢而死亡。因而這類抗生素在多數實驗中顯示了釋放LPS緩慢，釋放量較其它種類抗生素低的特性。環丙沙星由于能引起細菌絲狀改變，仍可導致LPS的大量釋放。另外一些研究發現，G－菌的外膜表面存在鈣、鎂陽離子。正常情況下它們起連接LPS與磷脂分子的橋梁作用，能穩定LPS分子。當去除這些離子后，LPS會變得不穩定而釋放出來。慶大霉素和環丙沙星可與鈣離子絡合，引起LPS釋放。這種作用能被過量的鎂離子所抑制。使細胞成分改變，造成膜的損傷，也是氨基糖甙類抗生素的作用機制之一。一些研究者認為，氯霉素引起的腦膜炎雙球菌釋放LPS，也是由于細胞膜的損傷，造成膜成分改變，使細菌細胞壁喪失了LPS的結合力所致。環丙沙星引起的細菌絲狀改變的機理不明［8～10］。
2．干擾細胞膜通透性類抗生素與LPS釋放：Gˉ細菌細胞壁較薄而疏松，粘肽只占細胞壁的10%～20%。而含有大量的LPS、脂蛋白和雙層磷脂的外膜，其內側為含類脂質的胞漿膜。多粘菌素B等多肽類抗生素由肽鍵連接的環狀高分子化合物組成，結構中有游離的-NH2和-COOH。帶正電的-NH2與Gˉ細菌胞膜中磷脂上帶負電的PO4-3結合，改變了細胞膜的通透性，使菌體內的氨基酸、核酸、K+等成分外漏而死亡。LPS中的類脂A也含有PO4-3，故認為多肽類抗生素具有中和LPS的能力。許多實驗已證實多粘菌素B作用于Gˉ細菌后，僅引起低而緩和的LPS釋放。細菌釋放出的LPS激活單核巨噬細胞釋放TNF-α，這一作用可被多粘菌素B抑制。如在用B型嗜血流感桿菌為模型的動物實驗中，單用頭孢他啶治療時，血中的TNF-α顯著增加，加用多粘菌素B后便抑制了約98%的TNF-α釋放。表明多粘菌素B能夠中和及減少Gˉ細菌釋放LPS，因而阻斷了由其引起的TNF-α釋放。最近發現氨基糖甙類也能結合LPS，但作用明顯不如多粘菌素B［11，12］。
3．青霉素結合蛋白與LPS釋放：傳統理論認為，β-內酰胺類抗生素的主要殺菌機制是抑制細菌細胞壁的合成。因為這類抗生素都含有一個β-內酰胺環，與細菌N-乙酰胞壁酸五肽的最后二肽，即D-丙氨酰酸相似，能竟爭結合轉肽酶，形成青霉噻唑酶，使其失活，轉肽過程中止，使細菌細胞滲透壓增高裂解而死亡。青霉素結合蛋白（penicillin binding proteins，PBPs）是細菌胞漿膜上的一種微小蛋白質，分子量在30000～150000 U之間。各種細菌PBPs譜不同，約3～10種，主要有6種，按分子量由大到小排序為：PBP1、PBP2、PBP3、PBP4、PBP5、PBP6。有的還有亞型：如PBP1a、PBP1b、PBP1c等。通過對底物分析，PBP1～3與肽多糖轉肽酶和葡萄糖轉移酶活性有關；PBP4～6與羧肽酶活性有關。現已明確，PBPs實際上是有關粘肽合成的一類催化酶-青霉素敏感酶（penicillin sensitive enzymes）。PBPs數量極少，僅占細胞膜蛋白總量的1%，每個細胞只有20～30個分子。個別的PBPs性質已比較清楚，如PBP5為一種D，D-羧肽酶，分子量50000 U。通過一較短親水肽（20～30個氨基酸）的羧基端嵌入在胞漿膜上，其氨基端和活性部位向外。每一種PBPs與β-內酰胺抗生素作用的詳細機制仍不清楚。目前比較重視的是PBP1～3。因為PBP1與細胞快速裂解有關；PBP2和PBP3與細菌形態改變有關，這些都與LPS釋放有關［13］。
不同的抗生素對不同的PBPs的親和力不同，同種抗生素在不同的濃度下對PBPs的結合類型也不同。如：伊米配能在1～2倍MIC(最低抑菌濃度)時，優先與PBP2結合，使細菌成為滲透壓穩定的大球形細胞，沒有裂解；濃度大于5倍MIC時，與PBP1親和力增加，導致迅速裂解。頭孢他啶在低濃度時優先與PBP3結合，使細菌變成絲狀；高濃度時也與PBP1結合，使細菌迅速裂解。初步認為其作用機理是，PBP1能控制細菌生長和菌體增大，是細菌生長的重要蛋白，主要功能為維持細胞形態，與抗生素結合可致細菌迅速裂解。PBP3能使細菌分裂停止，但不影響生長，故使細菌變成細長的絲狀，其長度可達原體積的30倍。PBP2的作用機理尚不清楚，可能與維持細胞有關。在一項以頭孢他啶（與PBP3結合）和伊米配能（與PBP2結合）的體外實驗表明，頭孢他啶引起的LPS釋放量大于伊米配能10倍。對于這種現象，目前認為與PBP3的結合使細菌發生絲狀變，生長沒有停止，隨著菌體的伸長LPS含量也不斷增加，當PBP1受抑止致細菌裂解時，便釋放出大量的LPS，其量明顯高于與PBP2結合的伊米配能引起的球形變（因生長停止）。兼有上述兩種變化的抗生素已在實驗室中觀察到，如美洛配能（meropenem）在濃度≤MIC時，與PBP3結合，引起絲狀變，釋放較多LPS，與頭孢他啶相似；在濃度＞2倍MIC時，與PBP2結合，出現球形變，釋放較少LPS，與伊米配能相似。但多數實驗表明，美洛配能主要與PBP3結合。同時也證明，伊米配能引起的LPS釋放及由此引起的TNF-α、IL-6等介質釋放量均低于優先與PBP3結合的抗生素，如：頭孢他啶、美洛配能、頭孢三嗪等［14～17］。
三、LPS血癥防治研究進展
抗生素的治療，雖然能有效殺滅入侵的病原體，但隨之而來的大量LPS釋放給許多嚴重感染性疾病的救治，造成了極大困難，目前臨床上尚缺乏有效地防治辦法。盡管近年來已發現了許多新的拮抗劑，但多數仍停留在探索階段。另外，隨著對抗生素作用機制認識的加深，已經發現一些抗生素具有中和或減少LPS釋放的能力。
1．免疫治療：（1）單克隆抗體（monoclonal antibody，McAb）:這類抗體種類較多，主要為IgM和IgG兩種，分別針對O-特異鏈、核心多糖和類脂A發揮作用。如：HA-1A、E5、McAb5B10、McAb8G9、McAb1B6、McAb3D10等。其中，較早應用于臨床的HA-1A由于療效差，存在嚴重不良副作用，因而已停用。E5（抗類脂A IgM抗體）臨床應用顯示了良好效果，能降低LPS和TNF-α，提高生存率。但對細胞結合型LPS無效。這是因為疏水的類脂A位于深部，受O-特異鏈遮蔽。但McAb1B6（Ig2A）能結合深部的類脂A。這些抗體通過中和LPS、促進單核細胞吞噬LPS及內在化作用發揮了良好的抗LPS作用。但這些抗體只能早期應用，過晚由于TNF-α已被激活釋放，因而不能改善LPS引起的炎癥反應［18］。(2)聯合免疫:由于單克隆抗體僅針對LPS，不能對已產生的細胞因子起作用。因而采用多種McAb聯合應用，比單一McAb更有效。Cross等［19］進行了由O-特異鏈McAb、J5多克隆抗血清和抗TNF-αMcAb組成的三聯免疫動物實驗。在沒有用抗生素的情況下，單用任何一種制劑的生存率為25%～43%；任何2種制劑聯合應用的生存率為50%～60%；3種制劑聯合應用的生存率為77%。
2．重組LPS中和蛋白：重組LPS中和蛋白（recombinant endotoxin neutralizing protein，rENP）以鱟制取，對各種細菌的LPS均有高度親和力。動物實驗表明rENP能夠顯著降低抗生素治療中的LPS和Gˉ細菌膿毒癥的病死率，其療效明顯高于HA-1A［20］。
3．LPS拮抗劑:E5531為無毒性的紅桿菌屬外膜中的類脂A成分，已由實驗室合成。E5531能竟爭結合LPS受體，抑制LPS介導的細胞毒作用。動物實驗表明，E5531與抗生素聯合使用，能明顯降低LPS的致死率［21］。
4．粒細胞抗菌蛋白:從多形核白細胞的嗜天青顆粒中，已分離出3種抗菌蛋白質：(1)殺菌性通透性增加蛋白（bactericidal permeability-increasing protein，BPI）；(2)抗菌15 Ku蛋白（antibacterial 15000 U protein isoforms，P15s）；(3)中性白細胞肽（nautrophil peptides，NPs）。BPI分子量55000 U，具有強大的殺菌、中和LPS和抑止TNF-α分泌的能力。P15s和NPs也具有一定的殺菌、中和LPS的能力，但對長鏈LPS（S型）無作用。3種蛋白經比較實驗，證明它們的作用強度為：BPI遠大于P15s，而后者與NPs相同。由于PBI的全部抗菌活性基團位于25000 u區域，因此已人工合成重組23000 U的BPI，即rBPI23。經臨床實驗證明，rBPI23能顯著降低LPS、TNF-α、IL-6、IL-8和IL-10水平，減少了中性白細胞脫顆粒作用，因而抑制了LPS引起的生物效應。在4周的臨床實驗期中，任何受試者體內沒有出現抗rBPI23抗體，肝、腎、骨髓功能無異常。除了部分受試者有短暫的皮膚潮紅外，無其它任何副作用，應用前景十分良好［22］。
5．具有中和、減少LPS釋放類抗生素：（1）多粘菌素B：由于其獨特的化學結構，人們已發現多粘菌素B具有中和LPS的能力。許多實驗已證明，該藥單獨或與其它抗生素聯合應用，均能減少LPS的釋放。但由于該藥抗菌譜窄，有嚴重腎毒性副作用，因而限制了該藥的應用范圍。為此，人們已將多粘菌素B制成了復合制劑，如：多粘菌素B-右旋糖酐70、多粘菌素B-IgG等。該類復合制劑降低了腎毒性，仍保留了殺菌力和中和LPS的能力［23，24］。（2）新型β-內酰胺類抗生素許多體內外實驗已經證實，凡與PBP2親和力強的β-內酰胺類抗生素僅導致較低的LPS釋放。已發現的這類抗生素有伊米配能、克拉維酸、氮卓脒青霉素、頭孢諾米、頭孢吡肟等。目前證明效果最好的是伊米配能。一項臨床對照實驗表明，LPS毒血癥患者，經治療4小時后，伊米配能（與PBP2結合）組的3例患者LPS水平已降低；頭孢他啶（與PBP3結合）組的4例患者LPS水平沒有降低，其中2例患者的LPS水平增加了。正在開發的新一代碳青霉烯類抗生素L-627（biapenem），不需與脫氫肽酶Ⅰ抑制劑聯用，殺菌作用更強，副作用更輕，尤其對大腸桿菌PBP2、PBP4，綠膿桿菌PBP1a、PBP2、PBP4顯示出強的親和性。其特性明顯優于第一代的伊米配能。而另2種已上市的碳青霉烯類抗生素美洛配能和帕尼配能（penipenem），主要與PBP3結合，無降低LPS的作用。選用優先與PBP2結合的抗生素，既能殺菌，又能減少LPS的釋放，可以提高嚴重感染性疾病的救治水平［14，16，17，25，26］。
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（收稿 ：1998-02-25 修回：1998-09-16）
