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經(jīng)典型的苯丙酮尿(Phenyketon uria簡PKU)是由苯丙氨酸羥化酶(PAH)的遺傳性 缺陷引起的一種先天性代謝病，其發(fā)病早在我國以為1/10000左右，雜合子頻率為 1/50. PKU的臨床表現(xiàn) PKU患兒由于苯丙氨酸羥化酶的缺乏或不是使苯丙氨酸在休丙大量堆識，并經(jīng)旁 路代謝途徑產(chǎn)生一系列的毒性代謝產(chǎn)物而該小兒產(chǎn)生一系列的明顯中毒癥狀.患兒在 剛出生時，由于無苯丙氨酸的攝入因此無臨表現(xiàn).隨著患兒的退食而連續(xù)出現(xiàn)智力進 行性下降，皮膚色素淺，肌張力高，驚厥發(fā)生，汗和尿中有特殊的臭味，最經(jīng)生活不 能自理，智力嚴重障礙. PKU的遺傳學 PKU是一種常染色體隱性遺傳病，患兒的父母為致病基因的攜帶者而患兒為純合 子.引起PKU的基因的PAH，該基因位于12q22-24.2全長約90kb，包括13個外顯子和12 個內(nèi)含子.內(nèi)切酶解分析顯示PAH的完整cDNA其有8個限制性內(nèi)切酶切點，形成10個 RFLP.在人群中這些RFLP可組成1536種單倍型.過去對PKU的診斷即用此連鎖分析.另外 在PAH基因內(nèi)含有數(shù)個VNTR和STR.外顯子3'鎖700bp處有-(TCTA)重復序列，外顯子 133'端下游3kb內(nèi)有-30bpVNTR，它們?nèi)杂惺畴s的遺傳病多態(tài)現(xiàn)象，可用為連鎖分析時 的標記. PAH基因突變類型 PAH基因的突變常見的有兩種類型即缺失和單堿基置換，在我國人群中，已檢測的 PKU均因PAH基因的單堿基量換所致.目前在我國其檢出了15種以上的點突變6見表，這 些點突變在我國南方和北方人群中的頻率有的不同.因此在PKU的診斷中注意這種差別. 中國人已檢出的PAH基因點突變
PAH基因點突變的PCR檢測 (一)PCR-ASO斑點雜交 在我國人群中，目前所發(fā)現(xiàn)的PAH基因突變以點突變?yōu)橹鳎虼丝梢源藖砗铣上?應的突變型寡核苷酸探針.來檢測PKU患者的點突變，ASO法是最為有效的點突變檢測 技術(shù).隨著非同位素標記探針的出現(xiàn)及反向斑點雜交的應用，預記該方法的臨床應用 將愈來愈廣泛.下表訓列即為利用PCR-ASO檢測時所用的引物. 探針
擴增時所用引物系根據(jù)每個外顯子兩側(cè)的旁側(cè)序列的設(shè)計.擴增片段包括完整的 外顯子區(qū)域其兩側(cè)部分內(nèi)含子序列. (二)3'-堿基特異PCR，高位特異PCR 在以PCR為主的已知突變檢測中，3'BSPCR是最簡便可行的一種檢測技術(shù).在應用 時，采用正常引物和突變引物兩組試驗，以確定何種引物可擴增，然后電泳確定有無相應的突變. 由個PAH各外顯子間的距離較大，各自有獨立的引物，因此可用多重PCR同時擴增數(shù) 個外顯子.不應同時，可將正常引物編為一組，突變引物編為一組進行兩組多滲PCR. 然后用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物以確定突變位點. 表所到即為國內(nèi)報道的用等位特異PCR 診斷PKU后用的相物及擴增片段，檢測位置
(三)用PCR直接檢測發(fā)生點突變的內(nèi)切酶點 在PKU已檢出的突變位點中，有七個位點的突變改變了限制性內(nèi)切酶的識別位點. 若用該酶切位點兩側(cè)的引物擴增包括內(nèi)切酶識別位點在內(nèi)的DNA的酶，然后將擴增產(chǎn)物用內(nèi)切酶 溶解，通過瓊脂糖凝膠電泳分離酶切點段，以判定個體有無該內(nèi)切酶識別位點的突變，引起內(nèi)切酶識別 位點改變的點突變見
(四)新的突變位點的PCR篩查: 對于有患者，不夠用上述的PCR方法檢出其突變位點，則可用PCR-SSCP，PGGE、 CDGE及其它的突變位點篩查技術(shù)進行篩查，以確定檢出的突彎位點與PKU的關(guān)系. PKUPCR診斷的途徑 (一)利用PCR-ASO檢測，近年來又發(fā)展了反向點雜交及非同位標記探針，與PCR-A SO應用起來更為方便，它是檢測PKU點突變的最為手段之一. (二)利用等位特異PCR(ASPCR) 若將ASP-PCR與多重PCR結(jié)合，形成MASP-PCR則一見可檢測多個突變位點，要是一 個非常有效的PKU診斷手段. (三)利用PCR-RFLP診斷 由于某些突變涉及到酶切位點的變化，因此右PCR-RFLP進行診斷PKU. PCR在PKU的產(chǎn)前診斷斷中的應用 由于PKU的治目前沿無有效的方法，因此其產(chǎn)前診斷，防止PKU患兒的出生具有重 要的意義，在PKU的產(chǎn)前診斷中，RFLP是較為傳統(tǒng)的診斷方法，操作費時，不能及時 提供臨床診斷信息，而且有相當大的一部分不能提供信息加止還要用同位素標記的探 針進行操作，因而大大的限制了其原因，應用PCR技術(shù)診斷PKU快速準確，易于滿足臨 床需要，而是便于推廣應用. (一)，PCR-ASO 傳統(tǒng)的PCR-ASO及類似的診斷方法盡管準確有效，但操作復雜，往往需要進行多 次操作，確診一測頗為費時，近年來應用的反向點雜交法(reverse dot bolt RDD)， 改變了傳統(tǒng)的點雜交程序，因而該其檢測時程明顯縮短，操作也較簡化.RDB是將一系 列的ASO探針先固定于膜上，然后用擴增的靶DNA與之雜交，在應用時，可將一些較為 常見的點突變探針固定于同一膜，而少見的固定于同一膜，因此結(jié)束分析樣品最多只 需雜產(chǎn)兩次即可完成PKU的診斷，在這種情況下，即使無證者一亦可進行產(chǎn)前診斷. (二)MASP.PCR 采用MASPPCR亦是進行已知PAU突變點基因產(chǎn)前診斷的簡易方法之一. (三)AmPFLP+PCR-SSCP快速診斷 盡管采用PCR-ASO和MASP-PCR可檢測全部的常見的PAH基因的已知點突變，但它只 能診斷約70～80%的PKU患者及浸入，仍有相當一部分不能同上述方法進行產(chǎn)前診斷， 我國董尚志等人利用PAH是國內(nèi)的STP及VNTR作為多態(tài)性標記結(jié)合PCR-SSCP進行產(chǎn)前診 斷，其診斷的準確率可達90%左右診方法包括以下幾步. 1.Amp-FLP連鎖分布：等用PAH基因內(nèi)含子中-STR多態(tài)性進行分析，可次66.2%的家之獲得有用的診斷信 息，其引物序列為:可擴增片段大小范圍為，擴增完畢合用變性膠(尿素)PAG電泳分析 擴增長產(chǎn)物的片段多態(tài)性和先證者及攜帶者對照，確定胎兒的基因組合，以判斷是否 為PKU患兒，若用連鎖分析不能診斷則進入下步 2.外顯子4PCR-SSCP 3.外顯子7，11，12SSCP分析：通過上述3步分析，診斷常可達90%以上，該方法簡使快速，準確率多，極適合于 基礎(chǔ)應用.若將PCR-ASORDB與Amp-FLP聯(lián)合應用，則定確率定高，況且要進行雜交，條 件及探治相對復雜，因此尚不夠廣泛推廣于臨床檢測. |
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