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甲型肝炎病毒是甲型肝炎的病原體.甲型肝炎呈世界性分布，其傳染源是甲型肝炎病人及病毒攜帶者.HAV主要隨糞便排出，但在血液、唾液、膽汁和十二指腸液也可查出.本病的傳播主要是通過糞--口途徑，如經(jīng)日常生活接觸傳播，經(jīng)污染飲水或食物而傳播.其中無黃疸型肝炎患者容易漏診或誤診，是重要的傳染源，具有重要的流行病學(xué)意義.除病人外，還有亞臨床感染，其無癥狀或有較輕微病狀，轉(zhuǎn)氨酶輕度升高，血清中可查出抗HAVIgM，糞便中可檢出HAAg或HAV顆粒，亦是不可忽視的較重要的傳染源. 甲型肝炎病毒經(jīng)糞--口途徑進(jìn)入消化道后，首先在腸上皮和局部淋巴結(jié)細(xì)胞內(nèi)繁殖，然后進(jìn)入血液形成病毒血癥，經(jīng)血液循環(huán)到達(dá)其靶器官--肝細(xì)胞中定居繁殖，引起肝功能異常，出現(xiàn)發(fā)熱、鞏膜黃染、小便濃茶色、惡心、厭油膩、血清轉(zhuǎn)氨酶升高等癥狀或體征. 甲型肝炎病毒為單股正鏈RNA病毒.直徑約27nm、呈20面立體對稱的球形顆粒，1982年國際病毒分類委員會曾將其分類為微小RNA病毒科腸病毒72型，隨著對HAV的不斷深入研究，發(fā)現(xiàn)其與腸病毒屬的成員有很多不同之處，國際病毒分類委員會于1991年將HAV重新分類為小RNA病科肝病毒屬，也有人建義命名為肝RNA病毒屬.它即強(qiáng)調(diào)了HAV的嗜肝性，又突出了HAV的基因是RNA，同時(shí)又與HBV嗜肝DNA病毒屬相對應(yīng). 一、甲型肝炎病毒的分子生物學(xué) (一)HAV基因組 HAV全基因約含7500個(gè)核苷酸，各HAV株間序列中的核苷酸數(shù)略有不同.其中HAV野毒株HM-175基因組全長7478個(gè)核苷酸，分5'端非編碼區(qū)和3'非編碼區(qū)及居于中間的開放閱讀框架區(qū)(編碼區(qū))三部分.5'端非編碼區(qū)是HAV基因組中最保守的部分.其株間核苷酸序列一致性達(dá)96～99%.此區(qū)共有734個(gè)核苷酸.5'非編碼區(qū)有2個(gè)聚嘧啶環(huán)，鄰近5'端的第一個(gè)聚嘧啶環(huán)是獨(dú)特的，不為其它RNA病毒所共有;第二個(gè)聚嘧啶環(huán)位于編碼區(qū)的起點(diǎn)附近，與其它小RNA病毒同源.5'非編碼區(qū)含有識別和連接宿主核蛋白體的重要遺傳信息.開放閱讀框架區(qū)編碼2227個(gè)氨基酸的多聚蛋白.被一個(gè)天門冬酰胺密碼子分開的2個(gè)蛋氨酸密碼中的任何一個(gè)可能是翻譯的起點(diǎn).其編碼多聚蛋白的基因從5'端開始可分為三個(gè)區(qū)，即P1區(qū)、P2區(qū)和P3區(qū).P1區(qū)編碼4個(gè)衣殼蛋白1A～1D，通常稱為VP1、VP2、VP3和VP4.VP1最大可能和VP3一起構(gòu)成抗原的免疫決定簇.P2區(qū)是轉(zhuǎn)錄及基因調(diào)控區(qū).P3區(qū)編碼非結(jié)構(gòu)蛋白3A、3B、3C和3D，HAV蛋白3B可共價(jià)結(jié)合于HAVRNA5'端，與啟動RNA的生物合成或與病毒的裝配有關(guān);HAV3D蛋白為依賴RNA的RNA多聚酶.代表了多聚酶的活性部位. P1區(qū):位于HAVRNA735～3107位核苷酸區(qū)域，為HAV衣殼蛋白編碼區(qū)，可編碼791個(gè)氨基酸.從5'端開始按其次序分別稱為VP4(735～803)，VP2(804～1469)，VP3(1470～2207)，VP1(2208～3107). (二)HAVRNA的基因型 HAV只有一個(gè)血清型.但通過對HAV核酸序列分析，發(fā)現(xiàn)HAV有若干個(gè)基因型.1991年Robertson用HAVP1區(qū)VP1基因的不同片段作為分型標(biāo)準(zhǔn)，將22株來自世界不同地區(qū)的HAV分為三個(gè)基因型(Ⅰ～Ⅲ型)，1992年他又對全球29個(gè)國家的152株HAV，以VP1和P2區(qū)的不同序列作基因分型，根據(jù)基因分型標(biāo)準(zhǔn)，把核苷酸序列差異<15%的劃為同一基因型.從而將HAV分為7個(gè)基因型(Ⅰ～Ⅶ型)，人類HAV有四個(gè)型，(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅶ)，非人靈長類亦有四個(gè)型(Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ).其中的Ⅲ型為人類和非人靈長類所共有的混合型.人類HAV各基因型間，核苷酸異源性為15～20%.同一基因型的不同亞型之間，異源性低于7.5%，同一亞型的地方流行株核苷酸異源性低于3%.但變異的核苷酸大多發(fā)生在密碼子的第三位上，不會改變氨基酸的組成，故各株間的抗原性差異不大. (三)基因變異 HAV的變異主要有自然變異，生物學(xué)變異和細(xì)胞培養(yǎng)變異及減毒變異.自然變異主要發(fā)生在P1區(qū)，其中VP1和VP3區(qū)變異較多見.HAV氨基酸的變異常發(fā)生在VP3的65、70和VP1的102、105、174、178和221位，而VP3的70位幾乎在所有的HAV株中都存在變異. Funkhouser等將在AGMK細(xì)胞上培養(yǎng)生長的HAV-175株，轉(zhuǎn)種到MRC-5細(xì)胞上培養(yǎng)，然后進(jìn)行核苷酸序列比較分析，發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)種株(適應(yīng)株)有13個(gè)核苷酸發(fā)生變異.其中有4個(gè)在5'非編碼區(qū)，9個(gè)在編碼區(qū)，Cohen等對HAV野毒株HM-175和減株HM-175/7MK5的cDNA核苷酸序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)有24個(gè)核苷酸發(fā)生變異，并導(dǎo)致12個(gè)氨基酸發(fā)生了變異.其中5'非編碼區(qū)有7個(gè)核苷酸發(fā)生變異，P1、P2和P3區(qū)分別有3、8和5個(gè)核苷酸發(fā)生變異;3'端非編碼區(qū)有一個(gè)核苷酸變異，因而認(rèn)為HAV的減毒是由于其基因組中相對小量的核苷酸改變所致.生物學(xué)變異主要是在核苷酸變異的基礎(chǔ)上，發(fā)生了對細(xì)胞的親和性的改變及HAV毒力性的改變. (四)引物的設(shè)計(jì)
二、病原學(xué)檢測現(xiàn)狀 1.HAV及HAAg的檢測:在潛伏期未與發(fā)病早期可用免疫電鏡檢出HAV，亦可用RIA和ELISA檢測血、尿、糞中的HAAg，此期也可采取上述標(biāo)本對HAV進(jìn)行培養(yǎng)鑒定. 2.檢測抗HAV、抗-HAVIgM和抗HAVIgA:急性期可用ELISA或RIA檢測血清中抗-HAVIgM，它是確診甲型肝炎的特異性血清學(xué)指標(biāo).其次抗-HAVIgA對于甲肝的早期診斷亦有意義. 3.HAVRNA:甲肝潛伏期與急性期早期，在血、尿、糞中用PCR技術(shù)或分子雜交檢測到HAVRNA，即可確診. 三、PCR應(yīng)用評價(jià) 由于在急性期與潛伏期未在血、尿、糞中均有HCV存在，用PCR技術(shù)擴(kuò)增檢測HCVRNA，非常適用于甲肝的早期診斷.它不僅可用于現(xiàn)癥病人的早期診斷，還能用于亞臨床感染者、隱性感者的檢測及環(huán)境污染HAV的監(jiān)測.是進(jìn)行流行病研究的重要手段. 但HCV是RNA病毒，做PCR時(shí)先要將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA后才能做PCR，而且一般要做巢式或雙PCR才能得出好的結(jié)果.其技術(shù)要求精度較高，程序較為繁復(fù)，但其特異性與敏感度是其它技術(shù)不可比擬的. 四、進(jìn)一步深入研究的課題方向 (一)用PCR進(jìn)行分型研究 建立HAVPCR分型方法，使HAV的流行病學(xué)研究進(jìn)入分子水平，用其來分析HAV的流行因素，流行特征及地理分布，確定暴發(fā)與傳染源之間的聯(lián)系，對甲型炎肝的防治具有重要意義. (二)毒力的分子生物學(xué)研究 研究HAV毒力的分子學(xué)基礎(chǔ)，有助于分析研究野毒株與減毒株之間核苷酸的變異性情況，確認(rèn)疫苗毒力減弱的基因標(biāo)志，可用于制備基因工程疫苗、監(jiān)視疫苗可能出現(xiàn)的回復(fù)突變. 乙型肝炎病毒 乙型肝炎是一種世界性傳染病，我國是高流行區(qū)，我國有50%～70%的人群受過乙型肝炎病毒的感染，有8%～10%為乙型肝炎表面抗原攜帶者，約有一億人口，根據(jù)1980年全國調(diào)查表明，我國現(xiàn)在患肝炎的病人約2000萬人，其中60%以上為慢性肝炎患者.乙型肝炎病毒又與肝硬變以及原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌密切相關(guān)，我國同時(shí)也是肝癌的高發(fā)國家;如何預(yù)防、如何治療、急待解決.解決這一問題的關(guān)鍵之一在于準(zhǔn)確無誤的診斷，要達(dá)到準(zhǔn)確無誤的診斷，就需要深入細(xì)致的研究乙型肝炎病毒的分子生物學(xué)特點(diǎn)，盡可能地采用現(xiàn)代分子生物技術(shù)加以研究和檢測. (一)病原學(xué):HBV為嗜肝DNA病毒(hepadna Virus). 1.形態(tài):完整的HBV顆粒呈園形，直徑42nm，雙層結(jié)構(gòu)，由外殼蛋白和核心成分組成.外殼蛋白包括S、前S1和前S2蛋白，核心成分則包括核心蛋白(HBCAg)、病毒(HBVDNA)和DNA多聚酶(DNA). 2.基因組:HBV基因組由一環(huán)形、部分雙鏈DNA組成.HBVDNA長鏈(一)約3.2Kb、短鏈S(+)約為400～1900bp.該基因組包括4個(gè)可被轉(zhuǎn)錄的開放讀碼區(qū)域---S、C、P和X區(qū)，P區(qū)與另外三個(gè)區(qū)重疊.S區(qū)由前S1、前S2和S基因組成，主要碼組成病毒外殼的三種不同蛋白，即大蛋白、中蛋白和主蛋白，C區(qū)編碼白(HBAg).P基因編碼病毒DNA多聚酶，為復(fù)制所必需.X基因產(chǎn)物為X蛋白，與HBV反式激活等功能有關(guān). (二)流行病學(xué) 1.地區(qū)分布:呈世界性分布，但不同地區(qū)差異很大，按人群中HBsAg攜帶率高低可劃分為三類:①低流行區(qū)(攜帶率<1%)，如北美、北歐、英等;②中流行區(qū)(1-5%)，如南歐、西南亞、俄羅斯等;③高流行區(qū)(10-20%).如東南亞、非洲和我國等.另外HBs5Ag的亞型地理分布也有明顯差異.adr多見于東南亞和我國;adw多見于美洲，澳大利亞和北歐;ayr罕見;而ayw分布最廣，由西非、北非、南歐、經(jīng)地中海至中東、南亞次大陸. 2.傳染源:各種類型的乙肝患者和HBsAg攜帶者.潛伏期為6周至6個(gè)月，平均為3個(gè)月. 3.傳播途徑:由于HBV存在于血液，唾液、淚液、腹水、羊水、尿、精液、陰道分泌物、月經(jīng)血和乳汁等中，所以傳播途徑多樣且復(fù)雜.但主要經(jīng)血液、母嬰和接觸傳播. (三)引物的設(shè)計(jì)
HPV型特異型引物
目前研究所采用的引物主要為上述幾種，從而構(gòu)成了HPV通用型診斷試劑和分型診斷試劑，其中，分型診斷試劑組成了5重性，即將HPV6～33各型引物混合在一起，一次PCR實(shí)驗(yàn)，即可對5種型別的HPV感染進(jìn)行確診. 應(yīng)用前景：PCR技術(shù)在診斷HPV感染和致癌研究中有其廣闊的應(yīng)用前景.現(xiàn)已應(yīng)用于檢測宮頸陰道組織細(xì)胞、陰肛部腫瘤、多種疣組織和口腔粘膜細(xì)胞中的HPV.由于該方法使簡便快速，可應(yīng)用于大范圍內(nèi)的流行病調(diào)查. PCR檢測HPV的核心問題：是如何使PCR發(fā)揮其實(shí)際應(yīng)用價(jià)值.以往，PCR應(yīng)用于實(shí)際檢測中的限制在于方法的繁瑣與較高的假陽性，如何克服這兩個(gè)問題是促成PCR臨床實(shí)際應(yīng)用的關(guān)鍵.從理論上講，PCR方法可以變得更為簡潔和定固化，亦即程序化，其結(jié)果應(yīng)是100%的特異和可靠.所以，實(shí)際工作是可以解決好上述兩個(gè)關(guān)鍵問題的.首先，應(yīng)用于PCR的關(guān)鍵試劑為TaqDNA聚合酶和特異引物對，作為TaqDNA聚合酶，它對模板的種類要求不嚴(yán)，它有很強(qiáng)的適應(yīng)性，活性范圍亦很好(70～79℃)因而它可對較為“粗糙”的標(biāo)本進(jìn)行較好的擴(kuò)增，故樣品的準(zhǔn)備過程的程度對擴(kuò)增反應(yīng)本身來講，影響不大，實(shí)踐中我們對該過程進(jìn)行了大量的簡化及改造，從而獲得成功，這極有利于PCR的常規(guī)化，易于為實(shí)驗(yàn)者所接受.另外重要的一點(diǎn)還有，簡化及快速的PCR程序，對于防止假陽性更有利.因?yàn)?font face="Times New Roman">PCR的假陽性經(jīng)常是因?yàn)闃悠烽g的交叉污染及空氣中的擴(kuò)增污染造成的，簡短，快速的實(shí)驗(yàn)程序能有效的的防止上述污染，這已為實(shí)踐所證明.PCR引物的特異性取決于引物的設(shè)計(jì)，選擇合適的擴(kuò)增片段是設(shè)計(jì)引物的關(guān)鍵環(huán)節(jié). 總之，PCR檢測HPV不管從特異性方面還是從靈敏性方面講具有其經(jīng)方法難以匹敵的優(yōu)勢，結(jié)果的可靠性及可信性應(yīng)該是最好的，是最權(quán)威性的檢測方法，加之本身方法的極大進(jìn)步，對于擴(kuò)充其應(yīng)用領(lǐng)域極其重要。 |
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