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一．熒光PCR原理
1．熒光共振能量傳遞 (FRET) 某熒光標(biāo)記基團(tuán)在激發(fā)光刺激下生成某波長(zhǎng)的發(fā)射光，當(dāng)另一屏蔽基團(tuán)與其距離合適時(shí)，原發(fā)射光將會(huì)被屏蔽基團(tuán)所吸收，并轉(zhuǎn)化為其他波長(zhǎng)的發(fā)射光或熱能，稱之為FRET。 2．熒光化學(xué)： 熒光定量PCR所使用的熒光化學(xué)可分為兩種：熒光探針和熒光染料。PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5’－3’外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。 二．實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)靶基因的確定及引物和探針的設(shè)計(jì)原則 1．靶基因的確定：選擇檢測(cè)組共有的基因以避免檢測(cè)的假陰性(漏檢)。 2．檢測(cè)片段的確定：選擇檢測(cè)組內(nèi)的保守 (突變少)（避免假陰性）、組間特異的序列 (突變多)（避免假陽性）作為引物探針的設(shè)計(jì)位置。片段長(zhǎng)度70-150bp。 3．引物：長(zhǎng)度17-25bp;GC含量30-80%;退火溫度(Tm值)58-60℃；避免穩(wěn)定的引物二聚體（特別是多聯(lián)檢測(cè)）及發(fā)夾結(jié)構(gòu)(自由能大于-3.5kc/m)；序列不能出現(xiàn)連續(xù)的G，3’端避免G或C，最后5個(gè)堿基內(nèi)避免兩個(gè)以上的G或C。 4．探針：長(zhǎng)度20-30bp（Taqman)或16-25bp(MGB)；GC含量30-80%；Tm值為68-70℃；避免穩(wěn)定的二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu) (自由能大于-3.5kc/m)；5’端不能是G；位置盡量靠近上游引物；選擇波長(zhǎng)差異較大（多聯(lián)檢測(cè)）或Fam(單聯(lián)檢測(cè)）的熒光標(biāo)記。 三.特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì) 1．特異性強(qiáng)：引物和探針的“雙保險(xiǎn)”，避免檢測(cè)的假陽性。 2．靈敏度高：分析PCR產(chǎn)物的對(duì)數(shù)期，自動(dòng)化儀器收集熒光信號(hào)，避免了許多人為因素干擾。 3．避免污染：全封閉反應(yīng)，無須PCR后處理。 4．實(shí)現(xiàn)定量：運(yùn)用標(biāo)準(zhǔn)品獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)合Ct值進(jìn)行準(zhǔn)確定量。 5．高效低耗：可實(shí)現(xiàn)一管多檢。 6．操作簡(jiǎn)便：在線式實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，不必接觸有害物質(zhì)。 7．快速：反應(yīng)時(shí)間<1.5小時(shí)。 四．實(shí)用意義： 1．提高檢測(cè)效率，縮短檢測(cè)周期，提高通關(guān)速度； 2．降低檢測(cè)成本，提高經(jīng)濟(jì)與社會(huì)效益。 |
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