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400熱線：400-833-9299 電話：010-82015225 13366202681 張鈺 QQ：1050524889 傳 真：010-6201513 聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（Single Strand Conformation Polymorphism Analysis of Polymerase Chain Reaction Products, PCR-SSCP）是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種基因分析方法。關(guān)于其原理及應(yīng)用請(qǐng)查看http://www.easylabs.com.cn/show.asp?id=369
為了高靈敏特異性地顯示SSCP分析結(jié)果，現(xiàn)已發(fā)展多種PCR-SSCP技術(shù)，各有其優(yōu)勢(shì)及適用領(lǐng)域。例如，可以在PCR擴(kuò)增中用同位素或熒光素等標(biāo)記引物或核苷，也可以在電泳后用銀染或溴化乙錠染色以顯示結(jié)果。這里將重點(diǎn)介紹最常用的放射性同位素PCR-SSCP法。在進(jìn)行PCR擴(kuò)增特定靶基因序列時(shí)，利用γ-32P-ATP標(biāo)記引物或直接在PCR反應(yīng)體系中加入α-32P-dCTP進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使擴(kuò)增產(chǎn)物帶有同位素標(biāo)記物，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物變性為單鏈進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，放射自顯影顯示結(jié)果。利用引物標(biāo)記或堿基摻入法使PCR擴(kuò)增產(chǎn)物帶有同位素標(biāo)記物，均可使產(chǎn)物信號(hào)增強(qiáng)幾個(gè)數(shù)量級(jí)。二者相比較，前者經(jīng)濟(jì)、擴(kuò)增特異性強(qiáng)，多用于大樣本的檢測(cè)和篩選；后者操作簡(jiǎn)便，適于一般實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展，可用于小樣本或大樣本的檢測(cè)和篩查。本節(jié)僅介紹同位素標(biāo)記堿基摻入法。
一、試劑準(zhǔn)備
⒈ PCR相關(guān)試劑
⒉ α-32P-dCTP
3. 5×TBE：每1000 mL中含54 g Tris堿、27.5 g硼酸、20 mL 0.5mol/L EDTA（pH 8.0）。
4. 10 mg/ mL溴化乙錠：100 mg溴化乙錠加入10 mL純水中，充分溶解，4℃儲(chǔ)存。
5. 30% 丙烯酰胺貯液（29:1）：將290 g丙烯酰胺和10 g N，N’-亞甲雙丙烯酰胺溶于總體積為600 mL的水中。加熱至37℃溶解之，補(bǔ)加水至終體積為1000 mL。
6. 10% 過(guò)硫酸胺：10 mL水中加入1 g過(guò)硫酸胺，充分溶解，4℃保存。
8. 8% 聚丙烯酰胺膠溶液：量取19 mL 30% 丙烯酰胺貯備液，12 mL 5×TBE，29 mL水，再加入420 μL 10%過(guò)硫酸胺和50 μL TEMEDN,N,N,N’－四甲基乙二胺)，充分混勻。
9. 0.1 %硝酸銀染色液：0.5 g硝酸銀溶解于500 mL水中，置于棕色瓶中備用。
10. 顯色液：取NaOH 10 g，Na2CO3 0.2 mg，加入到500 mL蒸餾水中，使其充分溶解，用時(shí)再加入甲醛500 μL。
11．變性上樣液：95% 甲酰胺、0.03%二甲苯青、0.05%溴酚藍(lán)、 20mM EDTA(pH 8.0)
二、操作步驟
⒈ PCR擴(kuò)增
反應(yīng)總體積為10μl，在0.5ml微量離心管中加入下列反應(yīng)成分：
10×buffer 1μl
dNTPmix 70μM
DNA模板 100ng
引物及Taq DNA酶 依實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求按比例加入
α-32P-dCTP 0.1μl
加ddH2O至 10μl
按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)循環(huán)參數(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，獲取擴(kuò)增產(chǎn)物。
⒉ 聚丙烯酰胺凝膠電泳
⑴ 電泳槽玻璃板的處理：用洗滌劑清洗玻璃板，自來(lái)水反復(fù)沖凈洗滌劑，雙蒸水沖洗3次，晾干，95％乙醇擦拭，自然干燥。用棉簽沾取SigmaCote涂于玻璃的貼膠面上， 5～10min后再用軟紙擦拭除去多余的SigmaCote溶液。在兩塊玻璃內(nèi)的兩側(cè)放好襯條對(duì)齊，用固定夾夾緊兩塊玻璃，并用玻璃膠帶封邊。
⑵ 制膠：按照被分離DNA片段的大小、含量及玻璃板、襯條的大小決定凝膠的濃度與體積，一般來(lái)講使用5％～8％的凝膠較為合適。輕輕搖勻配制的膠液于真空抽氣（開(kāi)始時(shí)要緩慢）除氣泡，加 35μl TEMED至聚丙烯酰胺混合液中，混勻。用10ml玻璃吸管或50ml注射器吸取膠液，將玻璃模具傾斜成60O角，緩慢注入兩玻璃板間的空隙中，直至灌滿模具頂部。立即插入相應(yīng)的點(diǎn)樣梳，（小心勿使梳齒下帶進(jìn)氣泡，并且不要將梳齒全部插入膠內(nèi)，留約2mm梳齒于玻璃板上端，以免拔梳時(shí)把膠孔拔斷）。由于凝膠在聚合過(guò)程中有回縮，所以應(yīng)小心添加些膠液于梳子處，水平放置，室溫聚合1hr。將封口玻璃膠帶掀去，放入電泳槽，凹型玻璃貼緊電泳緩沖液槽，用大號(hào)固定夾固定住兩側(cè)。在上下電泳槽內(nèi)灌入 1×TBE電泳緩沖液。小心取出點(diǎn)樣梳，用槽內(nèi)的緩沖液反復(fù)沖洗點(diǎn)樣孔，以去除可能存在的未聚合的聚丙烯酸胺和氣泡。
⑶ 擴(kuò)增產(chǎn)物的處理：將 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與變性上樣液按1：5的比例加入0.5ml 微量離心管中，混勻。樣品上膠前應(yīng)98 o C變性10min，立即冰浴驟冷。取約3～5μl變性樣品（根據(jù)點(diǎn)樣孔的大小決定上樣量），以微量加樣器上樣，（上樣時(shí)要注意不要有氣泡沖散樣品，而且速度要快，時(shí)間長(zhǎng)了樣品易于擴(kuò)散）。
⑷ 電泳：電泳槽接上電極（上槽接負(fù)極，下槽接正極）開(kāi)啟電源，根據(jù)擴(kuò)增片段的大小及電泳槽和凝膠的大小，決定電泳的電壓及電泳時(shí)間。通常室溫下以l～5V／cm電泳。
⑸ 剝膠：電泳結(jié)束后，倒棄電泳緩沖液，取下電泳膠玻璃，用塑料楔子從玻璃板底部一角小心分開(kāi)玻璃，凝膠應(yīng)附著在一塊玻璃上，切去凝膠左上角，作為點(diǎn)樣順序標(biāo)記。剪一張與玻璃同樣大小的濾紙，嚴(yán)密覆蓋于凝膠上，順一個(gè)方向?qū)⒛z緩慢取下，用保鮮膜蓋于膠面并包好，避免膜和膠之間產(chǎn)生氣泡或皺折，將凝膠固定在X線片夾中。
⑹放射自顯影：在暗室中將X線片貼于膠面，蓋嚴(yán)片夾，用黑布將X線片夾包裹，置-70℃放射自顯影。曝光時(shí)間根據(jù)同位素的強(qiáng)度而定，約 24h～10d。
⑺ 沖洗膠片從-70℃取出X線片夾，在暗室內(nèi)迅速取出X線片，立即顯影，以免使X線片上出現(xiàn)過(guò)多的冷凝水。（如果想再得到一張放射自顯影影像，可立即在片夾中裝一張新X線片并盡快放回到一70℃繼續(xù)顯影。如果來(lái)不及再加入新片即已出現(xiàn)冷凝水則應(yīng)使樣品凝膠和X線片夾都恢復(fù)到室溫，并擦去冷凝水后再裝入新的X線片）。依次按以下程序操作進(jìn)行顯影：
X線片顯影液顯影 1-5min
水洗 lmin
定影液定影 5min
流動(dòng)水沖洗 15min
所有使用液的溫度應(yīng)為18～20℃為宜。
三、注意事項(xiàng)
⒈ 核酸片段的大小: 用于SSCP分析的核酸片段越小，檢測(cè)的敏感性越高。對(duì)于<200bp的片段，SSCP可發(fā)現(xiàn)其中70％的變異；對(duì)于300bP左右的片段則只能發(fā)現(xiàn)其中50％的變異；而＞500bp的片段，則僅能檢出10％～3O％的變異，因此，<300bP，尤其是150bP左右的核酸片段更適于SSCP分析。對(duì)于大于400bp的PCR產(chǎn)物就需要設(shè)法進(jìn)一步處理，可以用限制性酶消化PCR產(chǎn)物，產(chǎn)生小于400bP的DNA片段，再進(jìn)行SSCP分析。℃
⒉ 游離引物: 游離引物可能同 PCR產(chǎn)物結(jié)合而改變其泳動(dòng)率，即使游離引物量為6nM都有明顯影響。因此，應(yīng)盡可能除去游離引物。可以采用不對(duì)稱引物擴(kuò)增方法，盡可能消耗多余的引物。也可以運(yùn)用過(guò)柱或磁性球方法純化PCR產(chǎn)物。或者是稀釋PCR產(chǎn)物，減少游離引物的干擾。
⒊ 低濃度變性劑: 凝膠中加入低濃度的變性劑，如5％-10％甘油、5％尿素或甲酸胺、10％二甲亞砜（DMSO）或蔗糖等有助于提高敏感性，可能是因?yàn)檩p微改變單鏈DNA的構(gòu)象，增加分子的表面積，降低單鏈DNA的泳動(dòng)率。但有些變異序列卻只能在沒(méi)有甘油的凝膠中被檢出。因此，對(duì)同一序列使用2～3種條件做SSCP，可能提高敏感性。
⒋ 電泳溫度: 一般認(rèn)為保持凝膠內(nèi)溫度恒定是SSCP分析最關(guān)鍵的因素，溫度有可能直接影響DNA分子內(nèi)部穩(wěn)定力的形成及其所決定的單鏈構(gòu)象，從而影響突變的檢出。室溫下電泳適于大多數(shù)情況，但由于在電泳時(shí)溫度會(huì)升高，為確保電泳溫度相對(duì)恒定，應(yīng)采取以下措施：減少凝膠厚度，降低電壓，有效的空氣冷卻或循環(huán)水冷卻等。
⒌ 凝膠的長(zhǎng)度: 可用測(cè)序板進(jìn)行SSCP分析，凝膠板長(zhǎng)度在40cm以上。
⒍ 凝膠濃度及厚度: 凝膠濃度很重要，一般使用5％～8％的凝膠，凝膠濃度不同，突變帶的相對(duì)位置也不相同，如果在進(jìn)行未知突變種類的SSCP分析時(shí)，最好采用兩種以上凝膠濃度，這樣可以提高突變種類的檢出率。凝膠的厚度對(duì)SSCP分析也很重要，凝膠越厚，背景越深，在上樣量較多的前提下，盡量使凝膠越薄越好。
⒎ 假陰性: 一般認(rèn)為，如沒(méi)有污染，PCR－SSCP分析不存在假陽(yáng)性結(jié)果，但可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果，后者是由于點(diǎn)突變引起的空間構(gòu)象變化甚微，遷移率相差無(wú)幾所致，尤其是點(diǎn)突變發(fā)生在擴(kuò)增片段的兩端時(shí)。如果有陽(yáng)性和陰性對(duì)照，結(jié)果可以重復(fù)確定的突變帶是可信的，如果沒(méi)有陽(yáng)性對(duì)照，應(yīng)經(jīng)測(cè)序來(lái)確定其是否為突變帶。由于PCR－SSCP的不足之處主要是可能檢出假陰性結(jié)果。應(yīng)通過(guò)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照，摸索電泳條件，假陰性結(jié)果在很大程度上是可以避免的。但對(duì)未知基因變異的檢測(cè)，假陰性結(jié)果就難以百分之百地消除。
8. 結(jié)果分析: 單鏈凝膠電泳時(shí)，互補(bǔ)單鏈遷移率不同，一般形成兩條單鏈帶。PCR產(chǎn)物進(jìn)行單鏈凝膠電泳之前，通過(guò)加熱變性產(chǎn)生單鏈。如變性不徹底，殘留雙鏈亦可形成一條帶．因此，PCR－SSCP分析結(jié)果至少顯示三條帶。但是，由于一種DNA單鏈有時(shí)可形成兩種或多種構(gòu)象，檢出三條或四條單鏈帶就不足為奇。
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