器材與試劑：
干粉型培養(yǎng)基、胰蛋白酶，青霉素、鏈霉素 . 純凈水系統(tǒng)、電子天平、 PH 計(jì)、磁力攪拌器。
具體步驟：
一 . 水的制備：
細(xì)胞培養(yǎng)用水必須非常純凈，不含有離子和其他的雜質(zhì)。需要用新鮮的雙蒸水、三蒸水或純凈水。
二 .PBS 的制備與消毒 ( 也可用于其它 BSS ，如： Hanks ， D-Hanks 液的配制 ) ：
1. 溶解定容：將藥品（ NaCl 8.0g ， KCl 0.2g ， Na2HPO4·H2O 1.56g ， KH2PO40. 2g ）倒入盛有雙蒸水的燒杯中，玻璃棒攪動(dòng)，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中準(zhǔn)確定容至 1000ml ，搖勻即成新配制的 PBS 溶液。
2. 移入溶液瓶?jī)?nèi)待消毒：將 PBS 倒入溶液瓶（大的吊針瓶）內(nèi)，蓋上膠帽，并插上針頭放入高壓鍋內(nèi) 8 磅 消毒 20 分鐘。注意高壓消毒后要用滅菌蒸餾水補(bǔ)充蒸發(fā)掉的水份。
三 . 胰蛋白酶溶液的配制與消毒：
胰蛋白酶的作用是使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解從而使細(xì)胞離散。不同的組織或者細(xì)胞對(duì)胰酶的作用反應(yīng)不一樣。胰酶分散細(xì)胞的活性還與其濃度、溫度和作用時(shí)間有關(guān)，在 pH 為 8.0 、溫度為 37℃ 時(shí)，胰酶溶液的作用能力最強(qiáng)。使用胰酶時(shí)，應(yīng)把握好濃度、溫度和時(shí)間，以免消化過(guò)度造成細(xì)胞損傷。因 Ca2+ 、 Mg2+ 和血清、蛋白質(zhì)克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液時(shí)應(yīng)選用不含 Ca2+ 、 Mg2+ 的 BSS ，如： D-Hanks 液。終止消化時(shí)，可用含有血清培養(yǎng)液或者胰酶抑制劑終止胰酶對(duì)細(xì)胞的作用。
1. 稱取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液濃度為 0.25 ％，用電子天平準(zhǔn)確稱取粉劑溶入小燒杯中的雙蒸水（若用雙蒸水需要調(diào) PH 到 7.2 左右）或 PBS （ D-hanks ）液中。攪拌混勻，置于 4℃ 內(nèi)過(guò)夜。
2. 用注射濾器抽濾消毒：配好的胰酶溶液要在超凈臺(tái)內(nèi)用注射濾器（ 0.22 微米微孔濾膜）抽濾除菌。然后分裝成小瓶于 -20℃ 保存以備使用。
四 . 抗生素溶液的配制
1. 所用純凈水（雙蒸水）需要 15 磅 高壓 20 分鐘滅菌。
2. 具體操作均在超凈臺(tái)內(nèi)完成。青霉素是 80 萬(wàn)單位 / 瓶，用注射器加 4ml 滅菌雙蒸水。鏈霉素是 100 萬(wàn)單位 / 瓶，加 5ml 滅菌雙蒸水，即每毫升各為 20 萬(wàn)單位。
3. 使用時(shí)溶入培養(yǎng)液中，使青鏈霉素的濃度最終為 100 單位 /ml 。 1 單位＝ 1 微克？
4. 細(xì)胞庫(kù)之細(xì)胞培養(yǎng)基不加抗生素
5.培養(yǎng)自ATC引進(jìn)之細(xì)胞株，培養(yǎng)基中不加抗生素。
6. 培養(yǎng)自其它實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)之細(xì)胞株，制作token freeze 前培養(yǎng)基須添加抗生素，待token freeze 通 過(guò)污染測(cè)試后，大量培養(yǎng)時(shí)則不加抗生素。
7. 寄送活細(xì)胞時(shí)，須將培養(yǎng)液充滿整個(gè) flask 時(shí)，則須添加抗生素 。 (penicillin 100 units/ml +streptomycin 100 ug/ml)
8. 若要檢測(cè)mycoplasma，則培養(yǎng)基內(nèi)不可添加gentamicin，因gentamicin 會(huì)抑制 mycoplasma 生長(zhǎng)。
9. 去除細(xì)菌污染之抗生素混合配方 : penicillin 250 units/ml, streptomycin 250 ug/ml, neomycin 250 ug/ml, bacitracin 2.5 units/ml
注意混合使用后藥物毒性會(huì)增強(qiáng)。
10. 抗生素使用種類與濃度：
工作濃度. 儲(chǔ)存溫度. 殺滅細(xì)菌
penicillin 100 units/ml -20℃ G(+) bacteria
streptomycin 100 ug/ml -20℃ G(+) and G(-) bacteria
chlotetracycline 50 ug/ml -20℃ G(+) and G(-) bacteria
gentamicin 50 ug/ml -20℃ G(+) and G(-) bacteria, mycoplasma
amphotericin B 2.5 ug/ml -20℃ yeast and molds
nystatin 50 ug/ml -20℃ yeast and molds
fungizone 2.5ug/ml -20℃ yeast and molds
五 .RPMI1640 的制備與消毒：
1. 溶解、調(diào) PH 值、定容：先將培養(yǎng)基粉劑加入培養(yǎng)液體積 2/3 的雙蒸水中 , 并用雙蒸水沖洗包裝袋 2-3 次 ( 沖洗液一并加入培養(yǎng)基中 ), 充分?jǐn)嚢柚练蹌┤咳芙?, 并按照包裝說(shuō)明添加一定的藥品 . 然后用注射器向培養(yǎng)基中加入配制好的青鏈霉素液各 0.5ml, 使青鏈霉素的濃度最終各為 100 單位 /ml 。然后用一個(gè)當(dāng)量的鹽酸和 NaOH 調(diào) PH 到 7.2 左右。最后定容至 1000ml ，搖勻。
2. 安裝蔡式濾器：安裝時(shí)先裝好支架，按規(guī)定放好濾膜，用螺絲將不銹鋼濾器和支架連接好。然后卸下支架腿分別用布包好待消毒。
3. 抽濾：配制好的培養(yǎng)液通常用濾器過(guò)濾除菌。通常用蔡式濾器在超凈工作臺(tái)內(nèi)過(guò)濾。
4. 分裝：將過(guò)濾好的培養(yǎng)液分裝入小瓶?jī)?nèi)置于 4℃ 冰箱內(nèi)待用。
5. 使用前要向 100ml 培養(yǎng)液中加入 1ml 谷氨酰胺溶液（ 4℃ 時(shí)兩周有效）。
六．血清：
１.血清的滅火：細(xì)胞培養(yǎng)常用的是小牛血清，新買來(lái)的血清要在 56℃ 水浴中滅火 30 分鐘后，再經(jīng)過(guò)抽濾方可加入培養(yǎng)基中使用。
1. 血清必須貯存于–20 ～ -70 ℃，若存放于4℃，請(qǐng)勿超過(guò)一個(gè)月。如果一次無(wú)法用完一 瓶，可
將40～45 ml 分裝于無(wú)菌50 ml 離心管中，由于血清結(jié)凍時(shí)體積會(huì)增加約10 %，必須預(yù)留此膨脹
體積之空間，否則易發(fā)生污染或容器凍裂之情形。
2. 一般廠商提供之血清為無(wú)菌，不需再無(wú)菌過(guò)濾。若發(fā)現(xiàn)血清有許多懸浮物，則可將血清 入
培養(yǎng)基內(nèi)一起過(guò)濾，勿直接過(guò)濾血清。
3. 瓶裝(500ml) 血清解凍步驟(逐步解凍法): -20 ℃ 或–70 ℃ 至4 ℃ 冰箱溶解一天，至室 溫下全
溶后再分裝，一般 50 ml 無(wú)菌離心管可分裝40～45 ml。在溶解過(guò)程中須規(guī)則搖 晃均勻(小心勿
造成氣泡 ，使溫度與成分均一，減少沈淀的發(fā)生。勿直接由－２０ ℃ 直接 至３７ ℃ 解凍，因溫度
改變太大，容易造成蛋白質(zhì)凝結(jié)而發(fā)生沈淀。
4. heat-inactivation 是指56 ℃, 30 分鐘加熱已完全解凍之血清。加熱過(guò)程中須規(guī)則搖晃均 勻。此
熱處理之目的是使血清中之補(bǔ)體成份(complement) 去活化。除非必須，一般 議作此熱處理，
因?yàn)闀?huì)造成沈淀物之顯著增多，且會(huì)影響血清之品質(zhì)。補(bǔ)體參與之反應(yīng)
有： cytolytic activities, contraction of smooth muscle, release of histamine from mast cells and
platelets, enhanced phag℃ytosis, chemotaxis and activation of lymph℃ytic and macrophage cell
type。
５.勿將血清置于３７ ℃太久，若在３７ ℃ 放置太久，血清會(huì)變得混濁，同時(shí)血清中許多較 不穩(wěn)定
之成份亦會(huì)因此受到破壞，而影響血清之品質(zhì)。
6. 血清之沈淀物
6.1. 凝絮物：發(fā)生之原因有許多種，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein) 變性 及解凍后
血清中存在之血纖維蛋白(fibrin) 造成，這些凝絮沈淀物不會(huì)影響血清本 身之品質(zhì)。若欲減少這
些凝絮沈淀物，可用離心3000 rpm, 5 min 去除，或離心后上 清液可以加入培養(yǎng)基中一起過(guò)濾。
不建議用過(guò)濾步驟去除這些凝絮沈淀物，因?yàn)闀?huì)阻塞過(guò)濾膜。
6.2. 顯微鏡下觀察之“小黑點(diǎn)”：通常經(jīng)過(guò)熱處理之血清，沈淀物的形成會(huì)顯著的增多。有些沈淀
物在顯微鏡下觀察像是 小黑點(diǎn) ，常會(huì)誤認(rèn)為血清遭受污染，而將血清 放在３７ ℃中欲培養(yǎng)此 微
生物“，但在37 ℃ 環(huán)境下，又會(huì)使此沈淀物增多，更 會(huì)誤認(rèn)為微生物之增殖，但以培養(yǎng)細(xì)菌之
培養(yǎng)基檢測(cè)，又沒(méi)有污染。一般而言，此黑點(diǎn)應(yīng)不會(huì)影響細(xì)胞之生長(zhǎng)，但若懷疑此血清之品
應(yīng)立即停用，更換另一批號(hào)的血清。
七 .HEPES 溶液：
HEPES 的化學(xué)全稱位羥乙基呱嗪乙硫磺酸（ N'-a-hydroxythylpiperazine-N'- ethanesulfanic acid ）。對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性作用。它是一種氫離子緩沖劑，能較長(zhǎng)時(shí)間控制恒定的 pH 范圍。使用終濃 度為 10-50mmol/L ，一般培養(yǎng)液內(nèi)含 20mmol/LHEPES 即可達(dá)到緩沖能力。
1mol/L HEPE 緩沖液配制方法如下：
準(zhǔn)確稱取 HEPTS 238.3g ，加入新鮮三蒸水定容至 1L 。過(guò)濾除菌，分裝后 4℃ 保存。
注意：因?yàn)楝F(xiàn)在市售 HEPES 為約 10g 包裝的小瓶，所以可根據(jù)實(shí)際情況靈活配制，但是要保證培養(yǎng)液內(nèi) HEPES 的終濃度仍然為 20m mol/L 。如：稱取 4.766 克 HEPES 溶于 20ml 三蒸水中，過(guò)濾除菌后可完全（ 20ml ）加入 1L 培養(yǎng)液中，或者每 100ml 培養(yǎng)液中加入 2ml 即可。
八 . 谷氨酰胺：
合成培養(yǎng)基中都含有較大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，細(xì)胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質(zhì)，谷氨酰胺缺乏要導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)不良甚至死亡。在配制各種培養(yǎng)液中都應(yīng)該補(bǔ)加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定， 4℃ 下放置 1 周可分解 50 ％，故應(yīng)單獨(dú)配制，置于 -20℃ 冰箱中保存，用前加入培養(yǎng)液。加有谷氨酰胺的培養(yǎng)液在 4℃ 冰箱中儲(chǔ)存 2 周以上時(shí)，應(yīng)重新加入原來(lái)的谷氨酰胺。一般培養(yǎng)液中谷氨酰胺的含量為 1 ～ 4mmol/L 。可以配制 200mmol/L 谷氨酰胺液貯存，用時(shí)加入培養(yǎng)液。配制方法為，谷氨酰胺 2.922g 溶于三蒸水加至 100ml 即配成 200mmol/L 的溶液，充分?jǐn)嚢枞芙夂螅^(guò)濾除菌，分裝小瓶， -20℃ 保存，使用時(shí)可向 100ml 培養(yǎng)液中加入 1ml 谷氨酰胺溶液。
九 . 肝素溶液的配制：
含有肝素的培養(yǎng)液可以使內(nèi)皮細(xì)胞純度提高，肝素加入全培養(yǎng)液中最終濃度為 50ug/ml 。因?yàn)楝F(xiàn)在市售的多為肝素鈉，包裝為約為 0.56 克 / 瓶，配制時(shí)，可將其溶于 100ml 三蒸水中，定容，過(guò)夜，然后過(guò)濾除菌，分裝小瓶，保存溫度為 ℃ 。使用時(shí)，向 100ml 培養(yǎng)液中加入 1ml （精確可加入 0.9ml ）即可。
十 . Ⅰ 型膠原酶：
0.1 ％ Ⅰ 型膠原酶溶液同胰蛋白酶一樣配制和消毒滅菌。注意：因?yàn)?Ⅰ 型膠原酶分子顆粒比胰酶大，不容易過(guò)濾，因此可以用蔡式濾器過(guò)濾除菌。分裝入 10ml 小瓶 -20℃ 保存。
十一 . 明膠溶液：
因?yàn)槊髂z難于過(guò)濾，所以配制 0.1 ％明膠溶液必須用無(wú)菌的 PBS 配制。所以制備過(guò)程中必須要注意無(wú)菌操作。首要的問(wèn)題是如何無(wú)菌準(zhǔn)確稱量 0.1 克 （配成 100ml 溶液） — 即解決無(wú)菌分裝藥品的問(wèn)題。其次要注意即使是 01. 的溶液，明膠也難溶，因此要充分搖勻，過(guò)夜放置，然后無(wú)菌分裝入 50ml 小瓶中， 4℃ 保存。
注意事項(xiàng)：
1. 配制溶液時(shí)必須用新鮮的蒸餾水。
2. 安裝蔡式濾器時(shí)通常使用孔徑 0.45 微米 和 0.22 微米濾膜各一張，放置位置為 0.45 的位于 0.22 微米的濾膜上方，并且要特別注意濾膜光面朝上。
3. 配制 RPMI1640 培養(yǎng)基時(shí)因?yàn)檫€要加入小牛血清，而小牛血清略偏酸性，為了保證培養(yǎng)液 PH 值最終為 7.2 ，可在配制時(shí)調(diào) PH 至 7.4 。
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