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生物知識

克隆/建庫/表達專用超級高效感受態細胞

作者:www.bilong.com 來源:網絡 發布時間: 2012-11-30 08:41  瀏覽次數:
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國外的同學說一般他們克隆都是直接購買感受態細胞轉化,實驗效率很高的。我總是以為如果是一般的克隆實驗,自己做感受態好像夠用了--如果是建庫,購買現成的感受態細胞就是非常必要的首選,因為轉化效率確實比實際手工制備的高2-3個數量級以上,特別是建庫,能實實在在地提高實驗的效率。實際上,除了建庫以外,Stratagene為更好的表達蛋白、以及轉化效率較低的巨無霸質粒,而特別優化了一些感受態細胞,做表達的人其實可以參考一下,有點用處的。生物通在這里借用Merck公司提供的資料供大家參考。

Stratagene的XL10-Gold®幾乎算得上是高效轉化的代名詞了,研究者一旦要克隆大質粒、連接DNA和建庫,克隆甲基化DNA,進行藍白斑篩選等,首選的就是XL10-Gold®和其衍生菌。XL10-Gold®用途包括:

--克隆大DNA:包括表達質粒,基因組DNA克隆

--構建質粒文庫:減少DNA大小偏倚性,使全長cDNA克隆、雙雜交質粒等各種大小的質粒轉化效率更接近,提高文庫代表性(比DH10B高25倍)。

Hte 基因型

Hte(高效轉化)基因型是Stratagene開發的特異性提高大質粒、連接DNA的宿主菌基因型,并使細胞生長加快(當天獲得菌落),已經成功應用于25kb超螺旋DNA和8kb連接DNA的克隆。XL10-Gold®,BL21-Gold,BL21-CodonPlus®,SoloPack® Gold 和96Pack® Gold等系列細胞都帶有這個新的性狀。

超級感受態細胞

Stratagene提供多種>5 x109 轉化子/μg 超螺旋DNA轉化效率的化學法超級感受態細胞正是克隆獲得大質粒、連接DNA克隆和建庫時最值得推薦的。

電轉化感受態細胞

Stratagene的電轉化感受態細胞特別耐受電擊處理,方便好用,在DNA材料極珍貴、量少時,或構建有代表性文庫時,建議采用電轉化感受態細胞。ElectroTen-Blue®細胞是目前商品化的電轉化感受態細胞中效率最高的,達到>3 x1010 轉化子/μg 超螺旋DNA。此外XL1-Blue,XL1-Blue MRF’,SURE®,ABLE® 和TG1等細 胞也提供電轉化形式感受態細胞。

SURE®-克隆不穩定DNA

大腸桿菌DNA修復系統會針對重復序列、二級結構(如Z-DNA)等真核DNA進行重排或刪除修飾。SURE感受態細胞針對uvrC,umuC,SbcC和RecJ等參與修飾的大腸桿菌基因或蛋白進行突變,提高了真核來源、不規則DNA的穩定性達20倍以上,并且適合克隆甲基化DNA。提供化學和電轉化感受態細胞,效率分別達1x1010 和1x109 。

ABLE®-克隆毒性DNA

目的DNA的蛋白產物常常對細胞產生毒性,通常的解決辦法是采用低拷貝質粒,或者采用極為嚴緊的表達調控。為了獲得穩定的克隆,ABLE細胞減少ColE來源質粒的拷貝數(如pUC、pBluescript系列載體),以達到保持相對較高拷貝數的同時使本底表達對于細胞的毒性降至最低的效果。

MR系列®-克隆甲基化DNA

真核基因組DNA常常因高度甲基化而被大腸桿菌修飾系統切割、刪除,在構建文庫時,由于要對cDNA進行甲基化保護,某些cDNA克隆也較難完成。采用Stratagene的MR (Minus Restriction)突變刪除了修飾系統的感受態細胞,可以構建質量非常高的cDNA和基因組文庫。這些細胞包括:用于大質粒克隆的XL10-Gold®超級感受態細胞,克隆連接DNA、轉化效率 目前最高的ElectroTen-Blue®電轉化感受態細胞,單次反應包裝的SoloPack® Gold,以及XL2-Blue MRF´ ,XL1-Blue MRF´ Kan(四環素抗性質粒),XL1-Blue MR(沒有F´附加體),克隆有二級結構的SURE細胞等。

重點推薦

Stratagene的ElectroTen-Blue(轉化效率>3×1010 )和Novagen的Nova XG Zappers(轉化效率>1×1010 )電轉化感受態細胞均具有endA-基因型,保證質粒優質高產;recA-重組缺陷基因型適合甲基化DNA克隆,確保片段不被刪除或重排;能以IPTG誘導進行藍白斑篩選(lacZΔM15),也使這兩種細胞非常好用。此外,ElectroTen-Blue還可被M13單鏈噬菌體感染(F’)。
 

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