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無血清造血細胞培養基http://www.pyjb.com.cn/a/gb2312/info/2013/0413/5029.html

腫瘤細胞在組織培養中占有核心的位置，首先癌細胞是比較容易培養的細胞。當前建立的細胞系中癌細胞系是最多的。另外腫瘤對人類是威脅最大的疾病。腫瘤細胞培養是研究癌變機理、抗癌藥檢測、癌分子生物學極其重要的手段。腫瘤細胞培養對闡明和解決癌癥將起著不可估量的作用。
一、組織培養腫瘤細胞生物學特性
腫瘤細胞與體內正常細胞相比，不論在體內或在體外，在形態、生長增值、遺傳性狀等方面都有顯著的不同。生長在體內的腫瘤細胞和在體外培養的腫瘤細胞，其差異較小，但也并非完全相同。培養中的腫瘤細胞具以下突出特點：
（－）形態和性狀
培養中癌細胞無光學顯微鏡下特異形態，大多數腫瘤細胞鏡下觀察比二倍體細胞清晰，核膜、核仁輪廓明顯，核糖體顆粒豐富。電鏡觀察癌細胞表面的微絨毛多而細密，微絲走行不如正常細胞規則，可能與腫瘤細胞具有不定向運動和錨著不依賴性有關。
（二）生長增殖
腫瘤細胞在體內具有不受控增殖性，在體外培養中仍如此。正常二倍體細胞在體外培養中不加血清不能增殖，是因血清中含有很細胞增殖生長的因子，而癌細胞在低血清中（2％～5％）仍能生長。已證明腫瘤細胞有自泌或內泌性產生促增殖因子能力。正常細胞發生轉化后，出現能在低血清培養基中生長的現象，已成為檢測細胞惡變的一個指標。癌細胞或培養中發生惡性轉化后的單個細胞培養時，形成集落（克隆）的能力比正常細胞強。另外癌細胞增殖數量增多擴展時，接觸抑制消除，細胞能相互重疊向三維空間發展，形成堆積物。
（三）永生性
永生性也稱不死性。在體外培養中表現為細胞可無限傳代而不凋亡（Apoptosis）。體外培養中的腫瘤細胞系或細胞株都表現有這種性狀，體內腫瘤細胞是否如此尚無直接證明。因惡性腫瘤終將殺死宿主并同歸于盡，從而難以證明這一性狀的存在。體外腫癌細胞的永生性是否能反證它在體內時同樣如此？也尚難肯定。從近年建立細胞系或株的過程說明，如果永生性是體內腫瘤細胞所固有的，腫瘤細胞應易于培養。事實上，多數腫瘤細胞初代培養時并不那么容易。生長增殖并不旺盛；經過純化成單一化瘤細胞后，也大多增殖若干代后，便出現類似二倍體細胞培養中的停滯期。過此階段后才獲得永生性，順利傳代生長下去。從而說明體外腫瘤細胞的永生性有可能是體外培養后獲得的。從一些具有永生性而無惡性性的細胞系，如NIH3T3、Rat－1、10T1/2等細胞證明，永生性和惡性（包括浸潤性）是兩種性狀，受不同基因調控，但卻有相關性。可能永生性是細胞惡變的階段。至少在體外是如此。
（四）浸潤性
浸潤性是腫瘤細胞擴張性增殖行為，培養癌細胞仍持有這種性狀。在與正常組織混合培養時，能浸潤入其它組織細胞中，并有穿透人工隔膜生長的能力。
（五）異質性
所有腫瘤都是由有增殖能力、遺傳性、起源、周期狀態等性狀不同的細胞組成。異質性構成同一腫瘤內細胞的活力有差別的瘤組織；處于瘤體周邊區的細胞獲得血液供應多，增殖旺盛，中心區有的細胞衰老退化，有的處于周期阻滯狀態，那些呈活躍增殖狀態的細胞稱干細胞（Stem Cells）、只有這些干細胞才是支持腫瘤生長的成分。腫瘤干細胞培養時易于生長增殖；把干細胞分離出來的培養方法稱干細胞培養。
（六）細胞遺傳
大多數腫瘤細胞有遺傳學改變，如失去二倍體核型、呈異倍體或多倍體等。腫瘤細胞群常由多個細胞群組成，有干細胞系和數個亞系，并不斷進行著適應性演變。
（七）其它
腫瘤細胞在體外不易生長的原因可能由于：①依賴性：腫瘤細胞雖有較強克隆生長力，但仍有一定的群體性或與其它細胞相依存關系。一是腫瘤細胞與腫瘤細胞的相互依存，二是腫瘤細胞與基質成纖維細胞的依賴。體外分散培養和排除成纖維細胞后也會同時消除或減弱這些依存關系，可能影響癌細胞增殖生長的活性；②腫瘤細胞的自泌也會因分散培養而被稀釋，達不到腫瘤生長的需求，降低腫瘤細胞的生長增殖力；③并非所有腫瘤細胞都有強的生長活力和長的Life Span，只有干細胞才有強的增殖生長能力，但這些細胞數量很少；④離體培養腫瘤細胞可能需求與體內相似的特殊生存條件。
二、培養方法
腫瘤細胞培養成功關鍵在于：取材、成纖維細胞的排除、選用適宜的培養液和培養底物等幾個方面。在具體培養方法方面，腫瘤細胞培養與正常組織細胞培養并無原則差別，初代培養應用組織塊和消化培養法均可。（一）要點
1．取材：
人腫瘤細胞來自外科手術或活檢瘤組織。取材部位非常重要，體積較大的腫瘤組織中有退變或壞死區，取材時盡量避免用退變組織，要挑選活力較好的部位。癌性轉移淋巴結或胸腹水是好的培養材料。取材后宜盡快進行培養，如因故不能立即培養，可貯存于4℃中，但不宜栽過24小時。
2．培養基：
腫瘤細胞對培養基的要求不如正常細胞嚴格，一般常用的 RPMIl640、 DMEM、Mc-Coy5A等培養基等皆可用于腫瘤細胞培養。腫瘤細胞對血清的需求比正常細胞低，正常細胞培養不加血清不能生長，腫瘤細胞在低血清培養基中也能生長。腫瘤細胞對培養環境適應性較大，是因腫瘤細胞有自泌（Autocrine）性產生促生長物質之故。但這并不說明腫瘤細胞完全不需要這些成分。按不同細胞需要不同的生長因子；腫瘤細胞與正常細胞之間、腫瘤細胞與腫瘤細胞之間對生長因子的需求都存在著差異。但大多數腫瘤細胞培養中仍需要生長因子。有的還需特異性生長因子〔如乳腺癌細胞等）。總之培養腫瘤細胞仍需加血清和相關生長因子培養更易成功。
3．成纖維細胞的排除：
成纖維細胞常與腫瘤細胞同時混雜生長，致難以純化腫瘤細胞。而且成纖維細胞常比腫瘤細胞生長得快，最終能壓制腫瘤細胞的生長。因此排除成纖維細胞成為腫瘤細胞培養中的關鍵。排除成纖維細胞有多種方法（表2－1）。

表2－1 抑制成纖維細胞生長因素

方法	因素	組織細胞
選擇性附著選擇性附著底物匯合飼細胞層選擇性培養基	胰蛋白酶膠原酶聚丙烯酰胺聚四氟乙烯（Teflon）膠原（豬皮）小鼠3T3 人胎小腸 D-纈氨酸（Valine） MCDB-710 MCDB-153 Phenobarbitone	胚胎小腸、心肌、表皮乳癌各種腫瘤轉化細胞表皮細胞表皮正常和惡性乳腺上皮結腸癌腎組織乳腺表皮肝細胞

注：上表結果為個別實驗室經驗，僅供參考

（二）成纖維細胞排除法
1．機械刮除法：
是用不銹鋼絲末端插有橡膠刮頭（用膠塞剪成三角形插以不銹鋼絲）、或裹少許脫脂棉制成，裝入試管中高壓滅菌后備用（也可用特制電熱燒灼器刮除）。刮除程序為：
（1）標記：鏡下觀察，用不脫色筆在培養瓶皿的背面圈下生長腫瘤細胞的部位；
（2）刮除：棄掉培養液，把無菌膠刮伸入瓶皿中，肉眼或顯微鏡窺視下，刮除無標記空間；
（3）用Hanks液沖洗一兩次，洗除被刮掉的細胞；
（4）注入培養液繼續培養，如發現仍有成纖維細胞殘留，可重復刮除至完全除掉為止
2．反復貼壁法：
根據腫瘤細胞比成纖維細胞貼壁速度慢的特點，并結合使用不加血清的營養液，把含有兩類細胞的細胞懸液反復貼壁，使兩類細胞相互分離，操作方法與傳代相同。
（1）待細胞生長達一定數量后，倒出舊培養液，用胰酶消化后，Hanks 沖洗2次，加入不含血清的培養液，吹打制成細胞懸液；
（2）取編號為此A、B、C三個培養瓶；首先把懸液接種入A培養瓶中。置溫箱中靜止培養5～20分鐘后，輕輕傾斜培養瓶，讓液體集中瓶角后慢慢吸出全部培養液，再接種入B培養瓶中后；向A瓶中補充少許完全培養液置溫箱中繼續培養；
（4）培養B瓶中細胞5～20分鐘后，接處理A的方法，把培養液注入C培養瓶中；再向B瓶中補加完全培養基。
當三個瓶內都含有培養液后，均在溫箱中繼續培養。如操作成功，次日觀察可見A瓶主要為成纖維細胞，B瓶兩類細胞相雜，C瓶可能主要為癌細胞。必要時可反復處理多次，直至癌細胞純化為止。
3．消化排除法：
此法曾用于乳癌細胞的培養，具體程序是：
（1）先是用0.5%胰蛋白酶和0.02％EDTA（1：1）混合液漂洗培養細胞一次，然后再換成新的混合液繼續消化，并在倒置顯微鏡下窺視和不時搖動培養瓶，到半數細胞脫落下來后，便立即停止消化；
（2）把消化液吸入離心管中，離心去上清，吸入另瓶中，加培養液置溫箱中培養；向原瓶內也補加新的培養液繼續培養。用此法處理后，成纖維細胞比腫瘤細胞易先脫落。經過幾次反復處理，可能把成纖維細胞除凈。
4．膠原酶消化法：
本法是利用成纖維細胞對膠原酶較為敏感的特點，通過消化進行選擇。
（1）可用0.5mg/ml的膠原酶消化處理，邊消化邊在倒置顯微鏡下窺視，當發現成纖維細胞被除掉后，即終止消化；
（2）用Hanks洗滌處理一次后，更換新培養液，繼續培養，可獲純凈腫瘤細胞。如成纖維細胞未被除凈，可再次重復。
5．其它方法：
有人發現聚丙烯酰胺有抑制成纖維細胞生長的作用；也有人用聚蔗糖制備成比重1.025～1.085的密度梯度離心液，加入細胞懸液后，在23℃中800g離心 10分種。在比重1.025～1.050層為成纖維細胞，在比重1.050～1.085層為上皮細胞，再經過分離進行培養。最近也有人應用特殊化學物如SOD抑制成纖維細胞生長的方法。
選用上述任何一種方法，都需進行試驗，取得必要經驗，找出適合的條件，才能獲得好的效果。
（三）提高腫瘤細胞培養存活率和生長率措施
根據人們的經驗，腫瘤細胞在體外不易培養，建立能傳代的腫瘤細胞系更為困難。當腫瘤組織或細胞初代接種培養后，常出現以下幾種情況：
完全無細胞游出或移動；
有細胞移動和游出，但無細胞增殖，細胞長時間處于停滯狀態以致難以傳代；
有細胞增殖，傳若干代后停止生長或衰退死亡；
傳數代后細胞增殖緩慢，經過一段停滯期后，才又呈旺盛生長狀態，形成穩定生長的腫瘤傳代細胞系。
以上現象說明腫瘤細胞對體外生存條件有較高的要求，并需經過對新環境的適應才能生長，因此欲獲得好的培養效果，不能局限于一般培養法，必須采用一些特殊的措施。
1．適宜底物：
把經過純化的細胞接種在不同的底物上，如鼠尾膠原底層、飼細胞層等。
2．生長因子：
應用促細胞生長因子，向培養液中增加一種或幾種促細胞生長因子。根據細胞種類不同選用不同的促生長物，常用有胰島素、氫化可的松、雌激素以及其它生長因子。
為提高腫瘤細胞對體外培養環境的適應力和增加有活力癌細胞（干細胞）的數量，可采用動物體轉嫁接種成瘤后，再從動物體內取出進行培養，能提高體外培養的成功率。受體動物以裸鼠最好。
3.動物體媒介培養方法：
（1）瘤塊接種：取新鮮瘤組織，用Hanks液洗凈血污，切成1～3毫米小塊，用穿刺針頭吸一小瘤塊，用酒精棉球擦拭動物腹部后，直接刺入皮下，注入瘤塊；
（2）飼養觀察，待腫瘤生長達較大體積后，剝取出瘤組織；
（3）進行體外培養。
（4）為防止失敗，仍取部分瘤組織繼續在裸鼠體內傳代。通過裸鼠媒介接種，有活力的腫瘤細胞數量增多，細胞培養易于成功。
腫瘤細胞培養方法與培養正常細胞完全相同，但成功率比正常細胞高。
（四）體外培養腫瘤細胞生物學檢測
一旦培養的腫瘤細胞生長成形態上單一的細胞群體或細胞系（或株）后，不論用于實驗研究還是建立細胞系，都需要做一系列的細胞生物學測定，主要的目的在于求得證明：
所培養的細胞系的確來源于原體內具有惡性的細胞，而非正常細胞或其它細胞。均具有瘤種特異性。闡明一般生物學性狀。測定項目數量無明確規定，根據需要而定，以下為常做的項目和要點。
【形態觀察】主要觀察細胞的一般形態，如大體形態、核漿比例、染色質和核仁大小、多少等以及細胞骨架微絲微管的排列狀態等。
【細胞生長增殖】檢測細胞生長曲線、細胞分裂指數、倍增時間、細胞周期時間。
【細胞核型分析】檢測核型特點，染色體數量、標記染色體的有無、帶型等。
【凝集試驗】檢測凝集力。
【軟瓊脂培養】檢測集落形成能力。
【異體動物接種】向異體動物體內（皮下）接種細胞懸液，觀察成瘤能力。
【其它】除上述項目外，根據需要還可做同位素標記、組織化學成分分析，熒光顯微鏡觀察等。
在上述腫瘤細胞生物學檢測中，最主要的為：異體動物（以用裸鼠為上）接種成瘤、軟瓊脂培養、核型分析、細胞骨架和電鏡觀察等幾項。當然從分子細胞學角度考慮尚應做癌基因和抗癌基因等的檢測，這些項目將在本書第二篇中介紹。
（五）對腫瘤細胞系或細胞株的評價
已建成的各種腫瘤細胞系或細胞株，無疑都是可用的實驗對象。近年我國已建成的腫瘤細胞系已非常多，并獲得越來越廣泛的應用。但根據研究者的經驗，在使用這些細胞系時，應持特別審慎態度，主要是應考慮到這些細胞在長期傳代中有否發生遺傳性改變的可能。眾所周知，長期傳代細胞系染色體核型常是不穩定的。另外也可能發生如基因突變、基因易位或缺失等變化。其結果可能導致細胞產生生物學性狀上的變動。以近年建成的各種腫瘤細胞系為例，都已傳代少則幾十，多則百代以上后，才確認建成了細胞系。這種情況下很難保證細胞從初代到建成時的性狀仍是一致的。已如前述，癌細胞在培養中并非能很順利地傳下去，凡已長期傳代的細胞系，都已獲得不死性。當前尚未完全確證所有癌細胞都具有不死性；因此尚難肯定在長期培養中的癌細胞的生物學性狀與體內時仍完全相同（包括不死性）。據上述對用癌細胞系所獲實驗結果應盡量做分析性的結論，避免做概括性的與體內等同的結論，外推與體內等同更是不妥的。廣泛來說，應用各種較長時間培養細胞做實驗時，都應如此。