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（二）成纖維細胞排除法
1．機械刮除法：
是用不銹鋼絲末端插有橡膠刮頭（用膠塞剪成三角形插以不銹鋼絲）、或裹少許脫脂棉制成，裝入試管中高壓滅菌后備用（也可用特制電熱燒灼器刮除）。刮除程序為：
（1）標記：鏡下觀察，用不脫色筆在培養瓶皿的背面圈下生長腫瘤細胞的部位；
（2）刮除：棄掉培養液，把無菌膠刮伸入瓶皿中，肉眼或顯微鏡窺視下，刮除無標記空間；
（3）用Hanks液沖洗一兩次，洗除被刮掉的細胞；
（4）注入培養液繼續培養，如發現仍有成纖維細胞殘留，可重復刮除至完全除掉為止
2．反復貼壁法：
根據腫瘤細胞比成纖維細胞貼壁速度慢的特點，并結合使用不加血清的營養液，把含有兩類細胞的細胞懸液反復貼壁，使兩類細胞相互分離，操作方法與傳代相同。
（1）待細胞生長達一定數量后，倒出舊培養液，用胰酶消化后，Hanks 沖洗2次，加入不含血清的培養液，吹打制成細胞懸液；
（2）取編號為此A、B、C三個培養瓶；首先把懸液接種入A培養瓶中。置溫箱中靜止培養5～20分鐘后，輕輕傾斜培養瓶，讓液體集中瓶角后慢慢吸出全部培養液，再接種入B培養瓶中后；向A瓶中補充少許完全培養液置溫箱中繼續培養；
（4）培養B瓶中細胞5～20分鐘后，接處理A的方法，把培養液注入C培養瓶中；再向B瓶中補加完全培養基。
當三個瓶內都含有培養液后，均在溫箱中繼續培養。如操作成功，次日觀察可見A瓶主要為成纖維細胞，B瓶兩類細胞相雜，C瓶可能主要為癌細胞。必要時可反復處理多次，直至癌細胞純化為止。
3．消化排除法：
此法曾用于乳癌細胞的培養，具體程序是：
（1）先是用0.5%胰蛋白酶和0.02％EDTA（1：1）混合液漂洗培養細胞一次，然后再換成新的混合液繼續消化，并在倒置顯微鏡下窺視和不時搖動培養瓶，到半數細胞脫落下來后，便立即停止消化；
（2）把消化液吸入離心管中，離心去上清，吸入另瓶中，加培養液置溫箱中培養；向原瓶內也補加新的培養液繼續培養。用此法處理后，成纖維細胞比腫瘤細胞易先脫落。經過幾次反復處理，可能把成纖維細胞除凈。
4．膠原酶消化法：
本法是利用成纖維細胞對膠原酶較為敏感的特點，通過消化進行選擇。
（1）可用0.5mg/ml的膠原酶消化處理，邊消化邊在倒置顯微鏡下窺視，當發現成纖維細胞被除掉后，即終止消化；
（2）用Hanks洗滌處理一次后，更換新培養液，繼續培養，可獲純凈腫瘤細胞。如成纖維細胞未被除凈，可再次重復。
5．其它方法：
有人發現聚丙烯酰胺有抑制成纖維細胞生長的作用；也有人用聚蔗糖制備成比重1.025～1.085的密度梯度離心液，加入細胞懸液后，在23℃中800g離心 10分種。在比重1.025～1.050層為成纖維細胞，在比重1.050～1.085層為上皮細胞，再經過分離進行培養。最近也有人應用特殊化學物如SOD抑制成纖維細胞生長的方法。
選用上述任何一種方法，都需進行試驗，取得必要經驗，找出適合的條件，才能獲得好的效果。
（三）提高腫瘤細胞培養存活率和生長率措施
根據人們的經驗，腫瘤細胞在體外不易培養，建立能傳代的腫瘤細胞系更為困難。當腫瘤組織或細胞初代接種培養后，常出現以下幾種情況：
完全無細胞游出或移動；
有細胞移動和游出，但無細胞增殖，細胞長時間處于停滯狀態以致難以傳代；
有細胞增殖，傳若干代后停止生長或衰退死亡；
傳數代后細胞增殖緩慢，經過一段停滯期后，才又呈旺盛生長狀態，形成穩定生長的腫瘤傳代細胞系。
以上現象說明腫瘤細胞對體外生存條件有較高的要求，并需經過對新環境的適應才能生長，因此欲獲得好的培養效果，不能局限于一般培養法，必須采用一些特殊的措施。
1．適宜底物：
把經過純化的細胞接種在不同的底物上，如鼠尾膠原底層、飼細胞層等。
2．生長因子：
應用促細胞生長因子，向培養液中增加一種或幾種促細胞生長因子。根據細胞種類不同選用不同的促生長物，常用有胰島素、氫化可的松、雌激素以及其它生長因子。
為提高腫瘤細胞對體外培養環境的適應力和增加有活力癌細胞（干細胞）的數量，可采用動物體轉嫁接種成瘤后，再從動物體內取出進行培養，能提高體外培養的成功率。受體動物以裸鼠最好。
3.動物體媒介培養方法：
（1）瘤塊接種：取新鮮瘤組織，用Hanks液洗凈血污，切成1～3毫米小塊，用穿刺針頭吸一小瘤塊，用酒精棉球擦拭動物腹部后，直接刺入皮下，注入瘤塊；
（2）飼養觀察，待腫瘤生長達較大體積后，剝取出瘤組織；
（3）進行體外培養。
（4）為防止失敗，仍取部分瘤組織繼續在裸鼠體內傳代。通過裸鼠媒介接種，有活力的腫瘤細胞數量增多，細胞培養易于成功。
腫瘤細胞培養方法與培養正常細胞完全相同，但成功率比正常細胞高。
（四）體外培養腫瘤細胞生物學檢測
一旦培養的腫瘤細胞生長成形態上單一的細胞群體或細胞系（或株）后，不論用于實驗研究還是建立細胞系，都需要做一系列的細胞生物學測定，主要的目的在于求得證明：
所培養的細胞系的確來源于原體內具有惡性的細胞，而非正常細胞或其它細胞。均具有瘤種特異性。闡明一般生物學性狀。測定項目數量無明確規定，根據需要而定，以下為常做的項目和要點。
【形態觀察】主要觀察細胞的一般形態，如大體形態、核漿比例、染色質和核仁大小、多少等以及細胞骨架微絲微管的排列狀態等。
【細胞生長增殖】檢測細胞生長曲線、細胞分裂指數、倍增時間、細胞周期時間。
【細胞核型分析】檢測核型特點，染色體數量、標記染色體的有無、帶型等。
【凝集試驗】檢測凝集力。
【軟瓊脂培養】檢測集落形成能力。
【異體動物接種】向異體動物體內（皮下）接種細胞懸液，觀察成瘤能力。
【其它】除上述項目外，根據需要還可做同位素標記、組織化學成分分析，熒光顯微鏡觀察等。
在上述腫瘤細胞生物學檢測中，最主要的為：異體動物（以用裸鼠為上）接種成瘤、軟瓊脂培養、核型分析、細胞骨架和電鏡觀察等幾項。當然從分子細胞學角度考慮尚應做癌基因和抗癌基因等的檢測，這些項目將在本書第二篇中介紹。
（五）對腫瘤細胞系或細胞株的評價
已建成的各種腫瘤細胞系或細胞株，無疑都是可用的實驗對象。近年我國已建成的腫瘤細胞系已非常多，并獲得越來越廣泛的應用。但根據研究者的經驗，在使用這些細胞系時，應持特別審慎態度，主要是應考慮到這些細胞在長期傳代中有否發生遺傳性改變的可能。眾所周知，長期傳代細胞系染色體核型常是不穩定的。另外也可能發生如基因突變、基因易位或缺失等變化。其結果可能導致細胞產生生物學性狀上的變動。以近年建成的各種腫瘤細胞系為例，都已傳代少則幾十，多則百代以上后，才確認建成了細胞系。這種情況下很難保證細胞從初代到建成時的性狀仍是一致的。已如前述，癌細胞在培養中并非能很順利地傳下去，凡已長期傳代的細胞系，都已獲得不死性。當前尚未完全確證所有癌細胞都具有不死性；因此尚難肯定在長期培養中的癌細胞的生物學性狀與體內時仍完全相同（包括不死性）。據上述對用癌細胞系所獲實驗結果應盡量做分析性的結論，避免做概括性的與體內等同的結論，外推與體內等同更是不妥的。廣泛來說，應用各種較長時間培養細胞做實驗時，都應如此。