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污染的類型 細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的污染不僅僅指微生物，而且還包括所有混入培養(yǎng)環(huán)境中的、對(duì)細(xì)胞生存有害或造成細(xì)胞不純的物質(zhì)，包括生物和化學(xué)物質(zhì)。 一、細(xì)菌污染 細(xì)菌污染是實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞培養(yǎng)中常見(jiàn)的污染，即使在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入了抗菌素(一般為預(yù)防劑量)，也可能因?yàn)椴僮鞑簧鞫鹞廴尽Ｗ畛Ｒ?jiàn)的有革蘭氏陽(yáng)性菌，如枯草桿菌以及大腸桿菌、假單胞菌等革蘭氏陰性菌，其中又以白色葡萄球菌較常見(jiàn)。 培養(yǎng)細(xì)胞受細(xì)菌污染后，會(huì)出現(xiàn)培養(yǎng)液變混濁，pH改變。也有的培養(yǎng)液肉眼觀察無(wú)多少改變，只能在鏡下發(fā)現(xiàn)菌體才知污染。所以，每天應(yīng)仔細(xì)觀察。污染后細(xì)胞發(fā)生病理改變，胞內(nèi)顆粒增多、增粗，最后變圓脫落死亡，造成試驗(yàn)失敗和細(xì)胞株(系)丟失。 二、真菌污染 真菌污染是細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中最常見(jiàn)的一種，尤其在霉雨季節(jié)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)更易污染。最常見(jiàn)的真菌有煙曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。 培養(yǎng)細(xì)胞受真菌污染后，可見(jiàn)培養(yǎng)液中漂浮著白色或淺黃色的小點(diǎn)，有的散在生長(zhǎng)，培養(yǎng)液一般不發(fā)生混濁;倒置顯微鏡下可見(jiàn)絲狀、管狀或樹(shù)枝狀的菌絲縱橫交錯(cuò)在細(xì)胞之間或培養(yǎng)基中，有的呈鏈狀排列。念珠菌和酵母菌呈卵圓形散在細(xì)胞周邊和細(xì)胞之間。個(gè)體細(xì)小，有增多趨勢(shì)。鏡下看時(shí)，要將培養(yǎng)瓶用酒精棉球擦干凈，以防止與瓶外尤其瓶底外面生長(zhǎng)的菌絲相混淆。真菌污染后，細(xì)胞生長(zhǎng)變慢，但最后由于營(yíng)養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細(xì)胞脫落死亡。 三、支原體污染 支原體是介于細(xì)菌與病毒之間能獨(dú)立生活的最小微生物，最小直徑0.2μm，一般過(guò)濾除菌無(wú)法去除它，光鏡下難以看清它的形態(tài)結(jié)構(gòu)。開(kāi)始不易發(fā)現(xiàn)，能在偏堿條件(pH7.6～8.0)下生存，對(duì)青霉素有抗藥性。多吸附于細(xì)胞表面或散在于細(xì)胞之間。電鏡下可見(jiàn)其有三層結(jié)構(gòu)，無(wú)細(xì)胞壁，中央有電子密度大的密集顆粒或絲狀的中心囊。 培養(yǎng)細(xì)胞受支原體污染后，部分敏感細(xì)胞可見(jiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖變慢，部分細(xì)胞變圓，從瓶壁脫落。但多數(shù)細(xì)胞污染后無(wú)明顯變化，或略有變化，若不及時(shí)處理，還會(huì)產(chǎn)生交叉污染。 四、病毒污染 采用組織細(xì)胞培養(yǎng)法生產(chǎn)疫苗，如果沒(méi)有除去潛在病毒的組織培養(yǎng)物，會(huì)產(chǎn)生病毒污染。目前，從原代猴腎細(xì)胞的培養(yǎng)中已發(fā)現(xiàn)不少于20種血清性病毒。盡管病毒污染的細(xì)胞不影響原代培養(yǎng)，但生產(chǎn)疫苗是不安全的。若二倍體細(xì)胞系有SV40或多發(fā)瘤病毒，B淋巴細(xì)胞含EB病毒，細(xì)胞和會(huì)發(fā)生變異、轉(zhuǎn)化，形成異倍體的細(xì)胞系。因此，潛在病毒是細(xì)胞大量生產(chǎn)和疫苗、干擾素等生物制品制作中的難題。 五、非同種細(xì)胞污染 由于細(xì)胞培養(yǎng)操作時(shí)各細(xì)胞株所需的器材和溶液沒(méi)有嚴(yán)格分開(kāi)，操作不當(dāng)，往往會(huì)使一種細(xì)胞被另一種細(xì)胞污染。如“靈長(zhǎng)類”細(xì)胞系發(fā)現(xiàn)猴和鼠類細(xì)胞的混合物，ERK/KD細(xì)胞是從兔腎中分離出來(lái)的，而現(xiàn)在句卻認(rèn)為是HeLa細(xì)胞。目前，世界上已有幾十種細(xì)胞都被HeLa細(xì)胞所污染，致使許多實(shí)驗(yàn)宣告無(wú)效。 非細(xì)胞培養(yǎng)物所造成的化學(xué)成分的污染也偶有發(fā)生，大多是由于細(xì)胞培養(yǎng)所需物品清洗消毒不徹底而帶入一些有毒化學(xué)物質(zhì)所致。 污染來(lái)源及鑒別 一、污染來(lái)源 細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中污染的來(lái)源主要有以下幾條途徑： 1、不潔的動(dòng)物組織標(biāo)本 很多動(dòng)物組織本該是無(wú)菌的(直接與外界相通的呼吸道和消化道、泌尿系統(tǒng)除外)，但由于取材時(shí)不小心也會(huì)有污染的機(jī)會(huì)。組織本身含有細(xì)菌，如取材時(shí)不用濃的抗生素洗液洗滌浸泡，也會(huì)帶菌，造成細(xì)胞污染。 2、空氣 空氣中含有大量的微生物，如果操作室與外界隔離不嚴(yán)或消毒不充分下，很容易造成污染。另外，凈化工作臺(tái)使用過(guò)久，濾板未定期更換或長(zhǎng)久不更換，濾氣受塵埃堵塞，工作時(shí)不帶口罩或外界氣流過(guò)強(qiáng)，污染空氣進(jìn)入操作區(qū)，也會(huì)導(dǎo)致污染。春夏季南方地區(qū)多雨，空氣濕度大，含菌量多，工作不注意也易造成污染。 3、清洗消毒 培養(yǎng)用物品、材料洗刷不凈，培養(yǎng)用液和器材滅菌不徹底也會(huì)引入微生物和有毒物質(zhì)。 4、操作 來(lái)自操作者的污染主要有以下幾方面： (1)器材和溶液使用前未仔細(xì)檢查是否污染過(guò)，或者是否已經(jīng)消毒滅菌處理過(guò)，或者雖經(jīng)處理，時(shí)隔已久又末重新處理。 (2)操作者未戴口罩、帽子，呼出氣中排出細(xì)菌和支原體。 (3)培養(yǎng)瓶口未用75%酒精擦和燒灼。 (4)操作者不當(dāng)心，動(dòng)作不正確而將吸管或無(wú)菌器具碰到了污染的物品，如手上皮膚和瓶子外壁等。 (5)操作者操作時(shí)大聲說(shuō)話，來(lái)回走動(dòng)揚(yáng)起灰塵等。 5、血清 市售血清滅菌不徹底，潛在病毒和支原體污染。 二、污染的鑒別 1、細(xì)菌、真菌污染的檢測(cè) (1)肉眼觀察 細(xì)菌、真菌污染常在傳代、換液、加樣等開(kāi)放性操作之后發(fā)生，而且增生迅速，若有污染，在48小時(shí)內(nèi)可明顯觀察到。如培養(yǎng)液變混濁，或略加振蕩有很多漂浮物漂起。 (2)鏡下觀察 在倒置顯微鏡的高倍鏡下可見(jiàn)培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒漂浮，即為細(xì)菌污染。若細(xì)胞之間有絲狀、管狀、樹(shù)枝狀或卵形的物質(zhì)常為真菌污染。 (3)接種觀察 采用普通肉湯接種或用未加雙抗藥物的培養(yǎng)液接種，也可發(fā)現(xiàn)是否有污染。 2、支原體污染的檢測(cè) (1)相差顯微鏡觀察 將細(xì)胞接種于事先放置于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的支持物(一般用長(zhǎng)形蓋玻片)，24小時(shí)后用清潔塵鑷子從培養(yǎng)瓶中取出支持物，細(xì)胞面向上放置于載物片上，再蓋上較大蓋玻片，用相差油鏡觀察;若不用支持物培養(yǎng)法，直接取少許培養(yǎng)液滴在載物片上，再蓋上蓋片觀察亦可。支原體在鏡下呈暗色微小顆粒，多位于細(xì)胞與細(xì)胞之間，有時(shí)可見(jiàn)類似于布朗運(yùn)動(dòng)的表現(xiàn)。應(yīng)注意與細(xì)胞破碎溢出的內(nèi)容物如線粒體等相區(qū)別。 (2)低漲處理地衣紅染色觀察 取已在培養(yǎng)瓶中的支持物蓋片或培養(yǎng)液，用新鮮配制的0.5%枸椽酸溶液處理蓋片細(xì)胞。用新配制的Carnoy液固定兩次，每次10分鐘，取出蓋片涼干。用培養(yǎng)液時(shí)，先吸取1mL，500～800r/min離心5分鐘后去除上清，留0.2mL，將0.5%枸椽酸溶液加入其中，置10分鐘，加入Carnoy液固定，離心棄上清固定液，余0.2mL沉淀物，制成2～3張涂片。然后用2%醋酸依地紅(地衣紅2g，冰醋酸60mL，加蒸餾水至100mL)染5分鐘。純酒精過(guò)三次，每次1分鐘，封入Euparal或樹(shù)膠中。若染色過(guò)深，可先用75%酒精脫色，再封片。鏡下觀察見(jiàn)支原體呈暗紫色小點(diǎn)，位于細(xì)胞外或細(xì)胞之間。 (3)熒光染色法觀察 用熒光染料Hoechst33258，此染料能與DNA特異地結(jié)合，可使支原體內(nèi)的DNA著色，然后用熒光顯微鏡觀察。染色方法為：用支持物蓋片培養(yǎng)法將細(xì)胞接種在蓋片上，在細(xì)胞匯合前(即未長(zhǎng)滿前)取出玻片，于碟皿中，用不含酚紅的Hanks液漂洗，1:3醋酸鉀固定10分鐘，再用生理鹽水漂洗后置于50μg/mL的Hoechst33258(生理鹽水配制)中染色10分鐘，置于蒸餾水漂洗1～2分鐘，向細(xì)胞面滴加數(shù)滴pH5.5磷酸緩沖液，然后置熒光顯微鏡下觀察。若用細(xì)胞培養(yǎng)液，先離心去除上清液，再加入Hanks液漂洗，離心棄上清后加入1:3醋酸甲醇固定10分鐘，再用生理鹽水漂洗后去上清液，再用Hoechst33258染色10分鐘，加入蒸餾水漂洗，離心去上清蒸餾水，加3～5滴pH5.5磷酸緩沖液，稍吹打使沉淀細(xì)胞重懸浮，用吸管吸出，滴于載物片上，蓋上蓋片后觀察。熒光顯微鏡下支原體呈綠色小點(diǎn)，散在于細(xì)胞周圍或附于細(xì)胞表面。 (4)電鏡檢測(cè) 若條件許可，可用掃描電鏡或透射電鏡觀察。一般在細(xì)胞培養(yǎng)48～72小時(shí)，細(xì)胞接近匯合前，用胰酶消化細(xì)胞制成細(xì)胞懸液后進(jìn)行。需經(jīng)過(guò)固定、包埋、切片后才能進(jìn)行觀察。詳細(xì)方法同細(xì)胞形態(tài)觀察法(見(jiàn)第九章)。 (5)培養(yǎng)檢測(cè) 將2.5×109/L細(xì)胞懸液5mL加入45mL支原體肉湯培養(yǎng)基(Sigma或北京生物制品所生產(chǎn)的均可)，培養(yǎng)14天后觀察肉湯培養(yǎng)有無(wú)霧狀沉淀，然后取0.5ml加入已冷卻到50℃的培養(yǎng)基中，再用瓊脂培養(yǎng)基做分離培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)3天觀察有無(wú)“荷包蛋”菌落出現(xiàn)。 污染的清除和預(yù)防 一、污染的清除 培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)污染，多數(shù)較難處理。如果污染細(xì)胞價(jià)值不大，宜棄之;有細(xì)胞株留存的或可購(gòu)置的，可在尋找原因后徹底消毒操作室，復(fù)蘇或重新購(gòu)置細(xì)胞，再培養(yǎng)。若污染細(xì)胞價(jià)值較大，又難于重新得到，可采取以下辦法清除。 1、使用抗生素 抗生素對(duì)殺滅細(xì)菌較有效。聯(lián)合用藥比單獨(dú)用藥效果好。預(yù)防用藥比污染后再用藥效果好。預(yù)防用藥一般用雙抗生素(青霉素100u/mL加鏈霉素100μg/mL)，污染后清除用藥需采用大于常用量5～10倍的沖洗法，于加藥后作用24～48小時(shí)，再換常規(guī)培養(yǎng)液。此法在污染早期可能有效。所用抗生素品種除青霉素、鏈霉素外，還可用慶大霉素、卡那霉素、多粘菌素、四環(huán)素、制霉菌素等。常用400～800μg/mL卡那霉素或200μg/mL四環(huán)素處理，每隔2～3日換液1次，傳1～2代進(jìn)行治療。近年來(lái)有報(bào)道，4-氟，2-羥基喹啉(Ciprofloxacin,Cip)、截耳素衍生物(Pleu-romutilin derivative, BM-Cyclin2:BM-1和四環(huán)素衍生物(BM-2)等三種抗生素單用或合用對(duì)殺滅支原體有效。這三種抗生素均用PBS配成250X濃縮液，-20℃保存?zhèn)溆茫褂脻舛菴ip為10μg/mL，BM-1為10μg/mL，BM-2為5μg/mL。使用時(shí)先吸除污染的培養(yǎng)液，加入含BM-1的RPMI1640培養(yǎng)液，3天后再吸除培養(yǎng)液，加入含BM-2的RPMI1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)4天，如此連續(xù)3個(gè)輪次，直至用33258熒光染色鏡檢證明已清除支原體后，再加正常培養(yǎng)液培養(yǎng)傳代3-4次。 2、加溫處理 將污染的組織培養(yǎng)物放在41℃培養(yǎng)18小時(shí)，可殺死支原體，但對(duì)細(xì)胞有不良影響。所以在處理前要進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，摸索能最大限度殺死支原體又對(duì)細(xì)胞影響最小的加熱時(shí)間。此法有時(shí)不可靠。若先用藥物處理后，再以41℃加溫處理效果更佳。 3、使用支原體特異性血清 用5%的兔支原體免疫血清(血凝效價(jià)1:320以上)可去除支原體污染，因特異抗體可抑制支原體生長(zhǎng)，故經(jīng)抗血清處理后11天即轉(zhuǎn)為陰性，并且5個(gè)月后仍為陰性。但此法比較麻煩，不如用抗生素方便、經(jīng)濟(jì)。 4、其他方法 除了上述去除污染的方法外，還有動(dòng)物體內(nèi)接種除菌法、巨噬細(xì)胞吞噬法、污染培養(yǎng)瓶中加溴尿嘧啶再用光照射的方法及過(guò)濾法等，但均較麻煩，且效果不確定。所以一旦支原體污染，除非有特別重要價(jià)值，一般均棄之重新培養(yǎng)。 二、污染的預(yù)防 預(yù)防是防止細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)生污染的最好辦法。只有預(yù)防工作做在前，才能將發(fā)生污染的可能性降到最小程度。一般預(yù)防可從以下幾方面著手： 1、從物品、用品消毒滅菌著手 細(xì)胞培養(yǎng)所用物品清洗、消毒要徹底，各種溶液滅菌除菌要仔細(xì)，并在無(wú)菌試驗(yàn)陰性后才能使用。操作室及剩余的無(wú)菌器材要定期清潔消毒滅菌。 2、從操作者做起 (1)操作者責(zé)任心要強(qiáng)，要細(xì)心穩(wěn)重，操作技術(shù)要熟練。進(jìn)無(wú)菌室前要用肥皂洗手或用5%新潔爾滅浸泡5分鐘，按規(guī)定穿隔離衣。進(jìn)入后關(guān)好門(mén)，坐下來(lái)盡量少走動(dòng)。工作開(kāi)始要先用75%酒精棉球擦手、擦瓶口和燒灼瓶口。事先要嚴(yán)格檢查器材、溶液和培養(yǎng)物，不要把污染品或未經(jīng)消毒的物品帶入無(wú)菌室內(nèi)，更不能隨便使用，以免造成大批污染。 (2)操作者動(dòng)作要輕，必須在火焰周圍無(wú)菌區(qū)內(nèi)打開(kāi)瓶口，并將瓶口轉(zhuǎn)動(dòng)燒灼。操作時(shí)盡量不要談話，若打噴嚏或咳嗽應(yīng)轉(zhuǎn)向背面。 (3)操作時(shí)要常更換吸管，切勿一根吸管做到底。一旦發(fā)現(xiàn)吸管口接觸了手和其他污染物品應(yīng)棄去。實(shí)驗(yàn)完畢及時(shí)收拾，保持實(shí)驗(yàn)室清潔整齊，最后用消毒水浸泡的紗布擦臺(tái)面。 3、防止細(xì)胞交叉污染 在進(jìn)行多種細(xì)胞培養(yǎng)操作時(shí)，所用器具要嚴(yán)格區(qū)分，最好做上標(biāo)記便于辨別。并按順序進(jìn)行操作，避免一起進(jìn)行時(shí)易發(fā)生混亂。 在進(jìn)行換液或傳代操作時(shí)，注射器和滴管不要觸及細(xì)胞培養(yǎng)瓶瓶口，以免把細(xì)胞帶到培養(yǎng)液中污染其他細(xì)胞。 所有細(xì)胞一旦購(gòu)置，或從別處引入，或自己建立，均應(yīng)及早留種凍存，一旦發(fā)生污染可棄之復(fù)蘇，重新培養(yǎng)。 lonza 無(wú)血清 培養(yǎng)基http://bitebo.com/a/gb2312/gongsixinxi/shichanghuodong/2013/0331/5024.html |
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