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| 購買進口儀器、試劑和耗材——就在始于2001年的畢特博生物 www.pyjb.com.cn |
前言：現在數據庫中有關于原代細胞培養的文章文獻數不勝數，但是令人遺憾的是，其中沒有一篇是很詳盡的說明原代培養的方法，沒有一個有解答出為什么要這樣做. 為了讓大家少走彎路，根據我殺過3000只老鼠的經驗，我把我這幾年摸索的經驗和大家分享，請求多投幾票得幾個叮當。相信你follow我的這篇文章一定會做的很好。 我的標題說的很像吹牛，但是我是嚴肅認真的說的，I earn it. note:這篇文章全是我個人的經驗，99。9%原創，經過無數失敗的到的最完美的原代神經元培養法，除了最后那一副圖是來自下面第2行那篇文獻，所以我才說是99.9%原創。 (注：附錄的圖是常用的消化酶對實驗的存活率影響，來自下面鏈接里的文獻)另外，成年鼠的原代培養我沒有摸索過，推薦一篇文獻在我以前的帖子(無需叮當)(http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=156&id=17651341&sty=3) 本篇專門討論胎鼠和新生鼠神經元的原代培養。 1.材料選擇。一定要嚴格按照國際上，NCBI數據庫，其他文獻的材料一致。胎鼠就要胎鼠，新生鼠就要新生鼠，不能混淆。因為新生鼠有一些受體，在培養的工作中失去功能，會不能再生，比如NMDA受體。和文獻不同會導致錯誤結論，甚至困惑。很多人寫信問我新生鼠的培養問題，我回答用新生鼠的實驗很少，八成是你自己搞錯了實驗對象，請確認國際上的相關研究文獻所用老鼠，再來問我下面的問題。 2，培養基選擇(neurbasal/neurobasal-a,invitrogen Co.ltd)。我強烈不建議用血清培養。原因是： 首先，血清刺激膠質細胞和雜細胞分裂，最后非常影響神經元產量; 其次，為了抑制膠質生長，往往要加入阿糖孢苷。嚴重的毒性會影響許多靈敏實驗; 再次，最重要的，血清培養的細胞狀態很不均一，從正常到凋亡都有，嚴重影響試驗準確，而無血清專用培養基所有的正常細胞都處于一樣的狀態，要么都好，要么都差，高度一致。 Invitrogen/GIBCO 無血清培養基neurobasal(neurbasal-A)被認為是最標準，最好的培養基。需要的添加劑為 B27和谷氨酰胺。培養出的細胞狀態均一，膠質細胞幾乎不分裂。其中，neurobasal是胎鼠培養基，而-A為新生鼠培養基。不過根據筆者實驗，沒什么太大區別，都能很輕松培養成功，但是，切忌中途換培養基，要從一而終。很多實驗室是不加抗生素的，也有的實驗室加。由于很多初學者操作不熟練，不注意，很多人會污染，所以我還是建議加雙抗。 注意!由于無血清培養基添加劑不是血清，而是人工合成的B27(也有用N2的，但是推薦B27，只差10美金)，血清有復雜的解毒作用而B27沒有，雙抗對細胞的干擾，無血清培養基要大的多。所以，如果你在neurobasal里添加抗生素，記得用量只要標準量的一半。 另一個添加成分谷氨酰胺溶液不穩定，所以每次用時候要現配現加。大概是0.5-2mmol/l大部分人用0.5mmol/l.雖然筆者試過，沒加這個也正常生長，但是幾乎所有文獻都添加，we just simply follow. 3.解剖過程一定要全程在冰上遇冷。這就意味著，從你處死母鼠后，胎鼠的大腦的溫度要最快的降低到0度。另外，在解剖過程中，胎鼠直到皮層或海馬被剪碎的過程，有時候可能需要2小時，如果樣品多。一定要注意多準備冰袋子。確保你的任何過程都在冰浴的培養液中進行(消化步驟除外)。這樣可以大大提高存活率。在解剖大腦時候，有人用hank's，在其中解剖。根據我的經驗，即使是0度，神經元還是在進行著很大程度代謝。所以，hanks的無糖環境很不利。我個人建議，用DMEM-高糖或DMEM-F12+馬血清來浸泡解剖過程中的大腦，來供給大腦的代謝，血清可以抑制神經凋亡。這其中還有一個問題，就是DMEM培養液會在空氣中變堿性。國外有的實驗室用L-15培養液來浸泡解剖過程中的腦，因為L-15不會再空氣中變堿性。沒有L-15的(國內幾乎沒有)，可以全程用DMEM-HG或者DMEM-F12+血清浸泡解剖過程中的腦。注意注意：一切操作都在冰浴的液體中，所以要多準備冰袋。(中途冰袋沒了的是豬頭) 4.關于培養皿的問題。一般來說，6孔板是最佳選擇。神經元讓人苦惱的問題是，神經元發育的情況和密度相關。大于6孔板(比如6CM DISH)會使得中間很難和周圍的細胞密度一樣，造成板中間和邊緣成熟度不一樣，而這會給實驗帶來很大干擾。而太小的話(96孔或128孔)細胞會傾向于向中間集中也會照成發育不均勻。所以筆者經驗是6孔板是最佳選擇。神經原代培養一定是要包被，用POLY-LYS或者膠原。 關于POLY-LYS包被，我們是包被30分鐘，吸干晾過夜，然后洗兩次，或者只洗一次但是要30分鐘接著晾干。由于neurobasal培養法相當成熟，所以沒必要用難固定的膠原。 5.處死母鼠并把胎鼠解剖時候，一定要注意母鼠狀態，是否有死胎，胎兒胎盤是不是正常，有多少胎，母鼠是多少天的(一般是E16-E18)這些信息也要嚴格記錄。處死孕鼠后，要立即取出子宮放入冰冷培養液中。注意孕鼠處死后要短暫的浸泡酒精消毒，防止污染。 一般來說，冰袋筆者選擇一面藍一面白的。藍的朝上，可以很清晰看到海馬結構。而去除血管膜的時候，白的那面朝上，這樣可以很清楚看到血管膜。 從處死老鼠到大腦被剝離出這段是人就會做，我就不多說了。不過有一點要注意，不管你是用皮層還是海馬，不要取一個分離一個，而是要快速把所有胎鼠大腦都迅速取出放到冰預冷的培養液中。我建議胎鼠取出來的時候胎鼠就放在冰冷的緩沖液中。就是說，處死后要迅速把大腦的溫度降到0. 6：最影響原代培養的成敗因素之一：這小段請大家一定注意看。無論皮層還是海馬，上面都是有一層血管膜。注意：一定要盡可能的去掉所有的血管和血管膜。可以用解剖顯微鏡。胎鼠很好剝離，而新生鼠則比較難。這里千萬不能粗心大意!!血管膜沒剝離干凈的后果是：1 吹打時候很難吹打下來神經元，被迫多次吹打，造成神經元大量死亡;2 血管膜一部分細胞會混入原代培養中，這些細胞往往會分裂，導致你的培養成果根本不能用。可以說，剝離的不好不干凈，實驗就是失敗的，不可能得到高質量的神經元。 注意的事情二：如果是要的是皮層的神經元原代培養，而皮層的細胞很多，切忌不要放太多皮層消化吹打!過多的細胞反而會導致神經元大量死亡。另外，請仔細注意文獻中要的是皮層哪一部位。沒有詳細要求的話一般是取頂端。 從大腦到單個海馬的剝離我不細說了。我現在以海馬神經元為例。在所有海馬都成功剝離后，請仔細的去除血管膜，原因上面說過。最后，請再仔細檢查一下是不是都去掉了。確認后，海馬片段被移入一個小燒杯里，加少量培養液，用剪刀剪成0.5-1立方毫米的小塊，放置冰上準備消化， 7：實驗成敗的關鍵之二：消化。一般來說，我看很多人都用0.125%的胰酶消化。實話說，胰酶消化非常的難以掌握速度，而且消化效果真的是--很爛!稍微不注意，就會消化過頭，細胞都消化光了。而胰酶消化的快，還會出現細胞快速破裂釋放出DNA，和其他蛋白纏結成絮狀包裹在組織塊外面，使得塊里面的不到應有的消化。所以我個人不推薦胰酶。 想做一個完美成功的消化，我強烈推薦木瓜酶+DNA酶。木瓜酶是消化過后，存活率最高的酶(見附圖)。筆者是配成2mg/ml的木瓜酶。另外要用的是DNA酶。DNA酶的作用是，消化掉破裂細胞的DNA，避免了釋放的DNA和蛋白纏結在組織塊表面而阻礙進一步消化。DNA酶由于各個公司的活性不一樣，很難有標準濃度，需要摸條件，不過不是很嚴格，只要能防止DNA纏結就好。 木瓜酶的特點是不會消化過頭，非常溫和。缺點是一定要現配(請直接用無血清的培養液配來保證神經元的營養代謝，而且一定要現用現配。 消化的技巧：消化時候，很多人有不良習慣，喜歡用個50ml試管裝著所有東西。結果是組織都沉底，下面消化不足，上面消化的沒細胞。筆者的技巧是，用一個6或10CM 培養皿來消化。這樣消化液在培養皿里形成淺而廣闊的一層，均勻分布著組織塊，從而徹底解決了上述問題。消化酶是2mg/ml木瓜蛋白酶+適量DNA酶。木瓜蛋白酶很便宜請放心。消化過程是20-30分鐘。由于木瓜蛋白酶溫和，因此不會消化過頭，使得你的實驗消化的很穩定。消化時候請在37度溫箱里，每5分鐘稍微搖動一下。 注意：1)木瓜酶不要用巰基化合物激活，激活后消化好很多但是成活率壞很多;2)盡量用不含血清的培養液來配置木瓜酶而不是用hanks，使得神經元保持營養;3)木瓜酶一定要現用現配。 再次重申：除了消化過程中要37度，其余任何時刻都是要浸泡在0度(冰浴)的液體中。消化過后可以用1ml血清終止反應(我是用馬血清，便宜，但是切忌不要用國產血清，污染幾率很大)。把消化用的培養皿放在冰上冷卻，然后墊高一面使得液體集中在另外一面便于吹打。整個體系靜止2-3分鐘，然后仔細的去掉上層的液體，保留消化過的組織塊 8.實驗成敗最關鍵最關鍵的：吹打。筆者經驗是，沒有必要用巴斯德管。對于胎鼠和10天之內的新生鼠，一般的1ml藍槍頭就可以達到滿意的效果。在一邊被墊高的皿里面，加入1-1.5ml新鮮培養基和少量DNA酶，吹打10次。吹打時候要注意，切忌過快，要緩慢吹打。吸入時候要很緩慢，吹出的時候可以略快，但是也要緩慢。輕柔吹打是細胞成活關鍵!要用進口槍頭，國產的有時候會過細。 我們采用的是最合理的分步吹打法。每個10次吹打過后，靜止2分鐘。這時候游離的單細胞在上面，而團塊會沉到下面去。上面的那層就是你要的單個懸浮細胞，把它們挪到指定容器里(一樣要冷在冰上)。下面沉淀下去的細胞團塊不要丟棄，再加1-1.5ml新鮮培養液，重復剛才的步驟，輕柔吹打，再靜止2分鐘，轉移上層的單細胞到剛才指定容器里，一共這樣分步吹打3次。3次之后如果還有團塊在下面，請果斷丟棄。造成這個的原因就是剛才的血管膜沒剝好。這個分步吹打的過程保證了每一個單細胞都避免了過度吹打，而分布吹打又保證了盡可能多的收獲單細胞。重申一下，為了保證最大程度收獲活細胞，每次吹打之前，可以加入少量DNA酶。這招可以更容易收獲大量高質量細胞，尤其是實驗材料不足時候。消化和吹打非常忌諱操作的細胞過多，這樣反而會使大量細胞死亡。實驗者如果是用的皮層這種原材料充足的話，切忌不要放入過多皮層。 9(可選可不選，但是我建議全選)神經元進一步純化。 一般來說，收獲的細胞懸液已經是很純的神經細胞了。但是，由于實驗者等個人或者客觀原因，血管膜可能不會被完全剝離;雜細胞可能也被吹入了細胞懸液;操作者手法不熟練，造成死細胞過多，影響種板等等原因，還是會影響到培養的神經元的質量。為了克服這些，筆者查了一些文獻，經過反復測試采用了nycoprep低轉速密度-梯度離心。現在這個梯度溶液已經被公司升級為optiprep.稀釋時候，NycoPrep™ 1.077 推薦稀釋成 60%，就用剛才懸浮細胞的培養液來配置。注意：1.077被廣泛應用于血液中分離血細胞，如果你拿到的nycoprep(optiprep)不是1.077，那么請換算一下稀釋度)值得注意的是，皮層和海馬可能需要的稀釋度稍微有不同。一般來說，一個10ml梯度離心管中，2-4ml稀釋過的梯度液體就夠用，取決于你收獲的細胞量多少。把你收獲的細胞懸液小心的加到稀釋好的梯度劑的上面一層，經過1500轉(不是15000請注意)5-8分鐘，神經元被高度壓縮到梯度面和上面的培養液分界面那一層。而最下面的梯度劑下的沉淀則是細胞團塊，血細胞，雜細胞，以及部分小膠質細胞。而最上層最浮頭，則是細胞碎片。這樣，你就得到了最大限度去除了雜細胞，和細胞碎片，并去掉了一定的膠質細胞的最干凈最純粹的神經元。如果實驗者技術精湛，也可以不用這步，但是用這步會效果更好。注意：母液稀釋到60%只是參考，具體實驗室不同可能略微有差別，要摸條件而不是死記硬背。另外皮層和海馬濃度也稍微有差別。有些文獻曾經報道，在梯度一定的情況下，一些特定梯度可以分開神經元和少突和其他膠質細胞，但是筆者從來沒成功過。 10.種板。這一步沒有那么非常重要，但是如果沒認真弄，濃度的不均一也會使得整個實驗失敗。記住的是，神經元原代培養是細節決定成敗，任何一個環節沒處理好，整個實驗都會失敗。 種板密度過低是非常有害的。首先，神經元互相接觸的幾率小，難以存活和成熟。其次，膠質細胞會大量分裂，導致神經元變得更少，從而得到失敗的實驗。 密度過高也是很有害的。由于營養爭搶，密度過高有可能導致局部細胞營養枯竭死亡。另外，高密度會導致細胞聚團，結果也是細胞不正常形態或者死亡，導致錯誤或失敗的實驗結果。 筆者的經驗是6孔板每一個孔要有7×100000 個正好(如果是臺酚藍染色只記錄活細胞，那么酌情減少密度)。注意，注意!!由于神經元的成熟速度和接種密度有很大關系，所以細胞計數一定要非常嚴肅認真!!!一定要所有格子都看!!如果發現計數板細胞不均勻，寧愿重新計數!!!由于接觸抑制現象，適當密度的神經元可以抑制膠質細胞生長，從而達到理想的實驗 由于neurbasal培養液相當昂貴，所以種板時候是不用它的，而第一次換液才用。一般種板時候我們用的是DMEM-HG或者DMEM-F12 +10%馬血清。注意一定要進口的。國產雜質很多會導致莫名其妙的細胞死亡。馬血清會抑制神經元凋亡并且抑制膠質細胞生長(FBS也可以，但是太貴) 種板注意事項一：種板時候的溶液推薦使用含有谷氨酸的培養液。神經元的NMDA等谷氨酸毒受體一般3天后才會出現。所以種板時候有谷氨酸不會導致細胞毒性反應。而這時候的谷氨酸反而是有利條件，可以促使神經元貼壁，從而提高存活率。 注意事項二(嚴格注意)種板后都是要搖晃板搖勻細胞，切記!千萬不能圈圈搖晃!!圈圈搖晃會導致神經元都集中到培養板的孔中間，導致濃度不均，生長不均勻，會直接導致實驗失敗。正確的搖法是左右平行翻轉角度，然后前后平行翻轉角度，千萬不要讓里面液體畫圈! 注意事項三(嚴格注意)種板后過過一定時間要換成正常標準培養神經元的neurobasal+b27+谷氨酰胺的無血清培養液。很多paper是1小時就換液，理由是膠質細胞貼壁差，會除去。但是筆者的經驗來看，這是極端錯誤的!1小時換液，神經元還沒有完全貼壁，這時候換液會吹下很多神經元，流到孔另外一側再貼壁，直接照成一個孔內細胞分布不均勻，從而成熟的不均勻。嚴格來說這種事情直接實驗失敗。 筆者的經驗是種板4-6小時換液，但是千萬不能超過12小時。原因是：超過12小時，混在細胞懸液中的大量細胞碎片也會牢牢貼壁，而細胞碎片直接影響神經元存活和正常代謝;另外12小時后，膠質細胞會開始分裂，這時候就很難抑制了。筆者推薦是4小時，但是別超過8小時。 注意事項四：4小時后換液時，請輕輕搖晃板幾下再換。原因：細胞碎片貼壁很慢而且不牢固，這時候的搖晃可以最大程度去掉細胞碎片。然后，注意：細胞請再用沒有加血清的，種板時候用的培養液清洗一次，也是要輕微搖晃，來進一步去除細胞碎片，從而得到良好的細胞生長環境。有條件也可以洗兩次，但是筆者覺得一次足夠。洗了之后吸干液體，換成neurbasal+B27+谷氨酰胺的神經元專用無血清培養基。 對于原代培養，是細節決定成敗，一個地方不夠好會滿盤皆輸，所以請嚴肅對待。 (德國隊的fans于凌晨) 下面是對版面一些犯錯誤的研究方法中最嚴重的錯誤之一的提醒，請大家注意，我把回帖編輯到這里了。enjoy. 剛回答了一系列形形色色的問題，我把這個問題挑明了說。 如果您不相信 neurobasal最好的而還是堅持用DMEM之類的培養液，麻煩檢查一下你們的DMEM或者MEM或者DMEM-F12的invitrogen產品序列號，到網站上檢查下相應的組成公式。很多這種培養液都是含有谷氨酸，而且是mmol級的。 成熟的神經元10um的谷氨酸即可照成細胞凋亡，而谷氨酸受體4-6天就開始表達，如果胎鼠神經元經歷了mmol濃度的培養液中的谷氨酸還不被毒死，那就是怪事了。 新生鼠不受這個限制，新生鼠原代培養沒有有功能的 NMDA受體， 最雷到我的，是板上有人用材料非常混亂，一會用胎鼠，一會用新生鼠，一會成年鼠的 你們這叫對自己不負責任! we do all cases seriously! 而不是憑借肉眼觀察和猜測。 做原代培養的，首先就是收集大量背景文獻，看看你的相關要求的國際公認的做法是用哪種。胎鼠和新生鼠雖然形狀一樣，但是神經元的功能一點都不一樣，表達受體都不一樣。 大部分實驗都是用胎鼠，而新生鼠往往用來培養測一些LTD之類的(not quite sure,文獻太少)，所以有人問我新生鼠的問題，我都是說你先看下背景文獻是不是你搞錯了。 而成年鼠是另外的培養方法，要求更小心仔細和特別的處理。硬套胎鼠的原代培養必然導致失敗。 另外，在一些藥物保護實驗中，不要以為NGF就一定對神經有很大作用，筆者的經驗是，想要細胞存活，FGF2是最佳選擇 但是，FGF2會導致細胞變化很大，所以還是別用在原代培養中，不過成年鼠培養一定要用FGF2。 對于一些雷到我的，我只能再次說，請收集足夠的背景文章在去選擇合適材料，please do it carefully and seriously! 祝大家都能培養出健康漂亮的神經元，歡迎大家來問問題(如果是美女的話，給個電話我會很開心) 聲明，除了最后一幅圖是來自別的文獻，前面所有的經驗都是我的原創，從無數失敗總結出的我認為最完美的神經原代培養。 最后，要跟大家提醒一下的是：nycoprep(optiprep)可能會存在不同的濃度，但是因為以前最常用的NycoPrep™ 1.077 ，所以作者默認的就是用此溶液配置的密度梯度。如果您使用的不是該密度梯度的，請自行換算一下。
lonza 無血清 培養基http://bitebo.com/a/gb2312/gongsixinxi/shichanghuodong/2013/0331/5024.html |
購買進口儀器、試劑和耗材——就在始于2001年的畢特博生物
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