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細(xì)胞實驗之4種轉(zhuǎn)染方法的比較：DEAE葡聚糖、磷酸鈣共沉淀法、脂質(zhì)體法、電穿孔法

作者：admin 來源：本站發(fā)布時間： 2014-07-19 13:08　瀏覽次數(shù)：

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轉(zhuǎn)染，是將外源性基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)的一種專門技術(shù)。隨著基因與蛋白功能研究的深入，轉(zhuǎn)染目前已成為實驗室工作中經(jīng)常涉及的基本方法。轉(zhuǎn)染大致可分為物理介導(dǎo)、化學(xué)介導(dǎo)和生物介導(dǎo)三類途。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染可以：
（1）真核細(xì)胞可以摻入外源DNA而獲得新的遺傳標(biāo)志；
（2）應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因動植物；
（3）應(yīng)用于生物制藥、基因治療、RNA干擾。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染

1. 轉(zhuǎn)染試劑的準(zhǔn)備

① 將400ul去核酸酶水加入管中，震蕩10秒鐘，溶解脂狀物。

② 震蕩后將試劑放在-20攝氏度保存，使用前還需震蕩。

2. 選擇合適的混合比例(1：1-1：2/脂質(zhì)體體積：DNA質(zhì)量)來轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在一個轉(zhuǎn)染管中加入合適體積的無血清培養(yǎng)基。加入合適質(zhì)量的MyoD或者EGFP的DNA，震蕩后在加入合適體積的轉(zhuǎn)染試劑，再次震蕩。

3. 將混合液在室溫放置10―15分鐘。

4. 吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用PBS或者無血清培養(yǎng)基清洗一次。

5. 加入混合液，將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一個小時。

6. 到時后，根據(jù)細(xì)胞種類決定是否移除混合液，之后加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時。

4種轉(zhuǎn)染方法的比較：

DEAE葡聚糖是最早應(yīng)用哺乳動物細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑之一，DEAE-葡聚糖是陽離子多聚物，它與帶負(fù)電的核酸結(jié)合后接近細(xì)胞膜而被攝取，用DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染成功地用用于瞬時表達(dá)的研究，但用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染卻不是十分可靠。

磷酸鈣共沉淀法因為試劑易取得、價格便宜而被廣泛用于瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的研究，先將DNA和CaCl2混合，然后加入到PBS中慢慢形成DNA磷酸鈣沉淀，最后把含有沉淀的混懸液加到培養(yǎng)的細(xì)胞上，通過細(xì)胞胞膜的內(nèi)吞作用攝入DNA。磷酸鈣似乎還通過抑制血清中和細(xì)胞內(nèi)的核酸酶活性而保護(hù)外源DNA免受降解.

脂質(zhì)體法采用陽離子脂質(zhì)轉(zhuǎn)染體，具有較高的轉(zhuǎn)染效率，不但可以轉(zhuǎn)染其他化學(xué)方法不易轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系，而且還能轉(zhuǎn)染從寡核苷酸到人工酵母染色體不同長度的DNA，以及RNA,和蛋白質(zhì).此外，脂質(zhì)體體外轉(zhuǎn)染同時適用于瞬時表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá)，與以往不同的是脂質(zhì)體還可以介導(dǎo)DNA和RNA轉(zhuǎn)入動物和人的體內(nèi)用于基因治療。人工合成的陽離子脂質(zhì)體和帶負(fù)電荷的核酸結(jié)合后形成復(fù)合物，當(dāng)復(fù)合物接近細(xì)胞膜時被內(nèi)吞成為內(nèi)體進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，隨后DNA復(fù)合物被釋放進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi).利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法最重要的就是防止其毒性，因此脂質(zhì)體與質(zhì)粒的比例，細(xì)胞密度以及轉(zhuǎn)染的時間長短和培養(yǎng)基中血清的含量都是影響轉(zhuǎn)染效率的重要問題.

電穿孔法常用來轉(zhuǎn)染如植物原生質(zhì)體這樣的常規(guī)方法不容易轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。電穿孔靠脈沖電流在細(xì)胞膜上打孔而將核酸導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。導(dǎo)入的效率與脈沖的強(qiáng)度和持續(xù)時間有關(guān)系，基因槍依靠攜帶了核酸的高速粒子而將核酸導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，這種方法適用于培養(yǎng)的細(xì)胞核在體的細(xì)胞.

轉(zhuǎn)染方法	原理	應(yīng)用	特點
磷酸鈣法	磷酸鈣DNA復(fù)合物吸附細(xì)胞膜被細(xì)胞內(nèi)吞	穩(wěn)轉(zhuǎn)，瞬轉(zhuǎn)	不適用于原代細(xì)胞，操作簡便但重復(fù)性差，有些細(xì)胞不適用
陽離子脂質(zhì)體法	帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞	穩(wěn)轉(zhuǎn)，瞬轉(zhuǎn) 所有細(xì)胞	適用性廣，轉(zhuǎn)染效率高，重復(fù)性好，但轉(zhuǎn)染時需除血清。轉(zhuǎn)染效果隨細(xì)胞類型變化大
電穿孔法	高脈沖電壓破壞細(xì)胞膜電位，DNA通過膜上形成的小孔導(dǎo)入	穩(wěn)轉(zhuǎn)，瞬轉(zhuǎn) 所有細(xì)胞	適用性廣但細(xì)胞致死率高，DNA和細(xì)胞用量大
DEAE-右旋糖苷法	帶正電的DEAE-右旋糖苷與核酸帶負(fù)電的磷酸骨架相互作用形成的復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞	瞬轉(zhuǎn)	相對簡便、結(jié)果可重復(fù)，但對細(xì)胞有一定的毒副作用，轉(zhuǎn)染時需除血清
病毒介導(dǎo)法	通過侵染宿主細(xì)胞將外源基因整合到染色體中	穩(wěn)轉(zhuǎn)	可用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、原代細(xì)胞，體內(nèi)細(xì)胞等
逆轉(zhuǎn)錄病毒		特定宿主	但攜帶基因不能太大細(xì)胞需處分裂期，需考慮安全因素
腺病毒	通過侵染宿主細(xì)胞將外源基因整合到染色體中	瞬時轉(zhuǎn)染特定宿主	可用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞需考慮安全因素
Biolistic顆粒傳遞法	將DNA用顯微重金屬顆粒沉淀，再將包被好的顆粒用彈道裝置投射入細(xì)胞，DNA在胞內(nèi)逐步釋放表達(dá)	瞬轉(zhuǎn)	可用于：人的表皮細(xì)胞，纖維原細(xì)胞，淋巴細(xì)胞系以及原代細(xì)胞
顯微注射法	用顯微操作將DNA直接注入靶細(xì)胞核	穩(wěn)轉(zhuǎn)，瞬轉(zhuǎn)	轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)有限，多用于工程改造或轉(zhuǎn)基因動物的胚胎細(xì)胞

其中樹枝狀聚合物(Dendrimers)和聚乙烯亞胺(Polyethylenimine，PEI)的轉(zhuǎn)染性能最佳，但樹枝狀聚合物的結(jié)構(gòu)不易于進(jìn)一步改性，且其合成工藝復(fù)雜。聚乙烯亞胺是一種具有較高的陽離子電荷密度的有機(jī)大分子，每相隔二個碳個原子，即每“第三個原子都是質(zhì)子化的氨基氮原子，使得聚合物網(wǎng)絡(luò)在任何pH下都能充當(dāng)有效的“質(zhì)子海綿”體。這種聚陽離子能將各種報告基因轉(zhuǎn)入各種種屬細(xì)胞，其效果好于脂質(zhì)聚酰胺，經(jīng)進(jìn)一步的改性后，其轉(zhuǎn)染性能好于樹枝狀聚合物，而且它的細(xì)胞毒性低。大量實驗證明，PEI是非常有希望的基因治療載體。目前在設(shè)計更復(fù)雜的基因載體時，PEI經(jīng)常做為核心組成成分。線型PEI與其衍生物用作基因轉(zhuǎn)染載體的研究比分枝狀PEI要早一些，過去的研究認(rèn)為在不考慮具體條件，LPEI/DNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物的細(xì)胞毒性較低，有利于細(xì)胞定位，因此與BPEI相比應(yīng)該轉(zhuǎn)染效率高一些。但最近研究表明BPEI的分枝度高有利于形成小的轉(zhuǎn)染復(fù)合物，從而提高轉(zhuǎn)染效率，但同時細(xì)胞毒性也增大。超高分枝的、較柔性的PEI衍生物含有額外的仲胺基和叔胺基，在染實驗中發(fā)現(xiàn)這種PEI的毒性低，但轉(zhuǎn)染效率卻較高。

lonza 無血清培養(yǎng)基

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細(xì)胞轉(zhuǎn)染

4種轉(zhuǎn)染方法的比較：

細(xì)胞實驗之4種轉(zhuǎn)染方法的比較：DEAE葡聚糖、磷酸鈣共沉淀法、脂質(zhì)體法、電穿孔法