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細胞實驗之4種轉染方法的比較：DEAE葡聚糖、磷酸鈣共沉淀法、脂質體法、電穿孔法

作者：admin 來源：本站發布時間： 2014-07-19 13:08　瀏覽次數：

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轉染，是將外源性基因導入細胞內的一種專門技術。隨著基因與蛋白功能研究的深入，轉染目前已成為實驗室工作中經常涉及的基本方法。轉染大致可分為物理介導、化學介導和生物介導三類途。

細胞轉染可以：
（1）真核細胞可以摻入外源DNA而獲得新的遺傳標志；
（2）應用于轉基因動植物；
（3）應用于生物制藥、基因治療、RNA干擾。

細胞轉染

1. 轉染試劑的準備

① 將400ul去核酸酶水加入管中，震蕩10秒鐘，溶解脂狀物。

② 震蕩后將試劑放在-20攝氏度保存，使用前還需震蕩。

2. 選擇合適的混合比例(1：1-1：2/脂質體體積：DNA質量)來轉染細胞。在一個轉染管中加入合適體積的無血清培養基。加入合適質量的MyoD或者EGFP的DNA，震蕩后在加入合適體積的轉染試劑，再次震蕩。

3. 將混合液在室溫放置10―15分鐘。

4. 吸去培養板中的培養基，用PBS或者無血清培養基清洗一次。

5. 加入混合液，將細胞放回培養箱中培養一個小時。

6. 到時后，根據細胞種類決定是否移除混合液，之后加入完全培養基繼續培養24-48小時。

4種轉染方法的比較：

DEAE葡聚糖是最早應用哺乳動物細胞轉染試劑之一，DEAE-葡聚糖是陽離子多聚物，它與帶負電的核酸結合后接近細胞膜而被攝取，用DEAE-葡聚糖轉染成功地用用于瞬時表達的研究，但用于穩定轉染卻不是十分可靠。

磷酸鈣共沉淀法因為試劑易取得、價格便宜而被廣泛用于瞬時轉染和穩定轉染的研究，先將DNA和CaCl2混合，然后加入到PBS中慢慢形成DNA磷酸鈣沉淀，最后把含有沉淀的混懸液加到培養的細胞上，通過細胞胞膜的內吞作用攝入DNA。磷酸鈣似乎還通過抑制血清中和細胞內的核酸酶活性而保護外源DNA免受降解.

脂質體法采用陽離子脂質轉染體，具有較高的轉染效率，不但可以轉染其他化學方法不易轉染的細胞系，而且還能轉染從寡核苷酸到人工酵母染色體不同長度的DNA，以及RNA,和蛋白質.此外，脂質體體外轉染同時適用于瞬時表達和穩定表達，與以往不同的是脂質體還可以介導DNA和RNA轉入動物和人的體內用于基因治療。人工合成的陽離子脂質體和帶負電荷的核酸結合后形成復合物，當復合物接近細胞膜時被內吞成為內體進入細胞質，隨后DNA復合物被釋放進入細胞核內.利用脂質體轉染法最重要的就是防止其毒性，因此脂質體與質粒的比例，細胞密度以及轉染的時間長短和培養基中血清的含量都是影響轉染效率的重要問題.

電穿孔法常用來轉染如植物原生質體這樣的常規方法不容易轉染的細胞。電穿孔靠脈沖電流在細胞膜上打孔而將核酸導入細胞內。導入的效率與脈沖的強度和持續時間有關系，基因槍依靠攜帶了核酸的高速粒子而將核酸導入細胞內，這種方法適用于培養的細胞核在體的細胞.

轉染方法	原理	應用	特點
磷酸鈣法	磷酸鈣DNA復合物吸附細胞膜被細胞內吞	穩轉，瞬轉	不適用于原代細胞，操作簡便但重復性差，有些細胞不適用
陽離子脂質體法	帶正電的脂質體與核酸帶負電的磷酸基團形成復合物被細胞內吞	穩轉，瞬轉所有細胞	適用性廣，轉染效率高，重復性好，但轉染時需除血清。轉染效果隨細胞類型變化大
電穿孔法	高脈沖電壓破壞細胞膜電位，DNA通過膜上形成的小孔導入	穩轉，瞬轉所有細胞	適用性廣但細胞致死率高，DNA和細胞用量大
DEAE-右旋糖苷法	帶正電的DEAE-右旋糖苷與核酸帶負電的磷酸骨架相互作用形成的復合物被細胞內吞	瞬轉	相對簡便、結果可重復，但對細胞有一定的毒副作用，轉染時需除血清
病毒介導法	通過侵染宿主細胞將外源基因整合到染色體中	穩轉	可用于難轉染的細胞、原代細胞，體內細胞等
逆轉錄病毒		特定宿主	但攜帶基因不能太大細胞需處分裂期，需考慮安全因素
腺病毒	通過侵染宿主細胞將外源基因整合到染色體中	瞬時轉染特定宿主	可用于難轉染的細胞需考慮安全因素
Biolistic顆粒傳遞法	將DNA用顯微重金屬顆粒沉淀，再將包被好的顆粒用彈道裝置投射入細胞，DNA在胞內逐步釋放表達	瞬轉	可用于：人的表皮細胞，纖維原細胞，淋巴細胞系以及原代細胞
顯微注射法	用顯微操作將DNA直接注入靶細胞核	穩轉，瞬轉	轉染細胞數有限，多用于工程改造或轉基因動物的胚胎細胞

其中樹枝狀聚合物(Dendrimers)和聚乙烯亞胺(Polyethylenimine，PEI)的轉染性能最佳，但樹枝狀聚合物的結構不易于進一步改性，且其合成工藝復雜。聚乙烯亞胺是一種具有較高的陽離子電荷密度的有機大分子，每相隔二個碳個原子，即每“第三個原子都是質子化的氨基氮原子，使得聚合物網絡在任何pH下都能充當有效的“質子海綿”體。這種聚陽離子能將各種報告基因轉入各種種屬細胞，其效果好于脂質聚酰胺，經進一步的改性后，其轉染性能好于樹枝狀聚合物，而且它的細胞毒性低。大量實驗證明，PEI是非常有希望的基因治療載體。目前在設計更復雜的基因載體時，PEI經常做為核心組成成分。線型PEI與其衍生物用作基因轉染載體的研究比分枝狀PEI要早一些，過去的研究認為在不考慮具體條件，LPEI/DNA轉染復合物的細胞毒性較低，有利于細胞定位，因此與BPEI相比應該轉染效率高一些。但最近研究表明BPEI的分枝度高有利于形成小的轉染復合物，從而提高轉染效率，但同時細胞毒性也增大。超高分枝的、較柔性的PEI衍生物含有額外的仲胺基和叔胺基，在染實驗中發現這種PEI的毒性低，但轉染效率卻較高。

lonza 無血清培養基

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