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細胞培養(yǎng)基的種類繁多，細胞培養(yǎng)方式也較多，如何正確地使用培養(yǎng)基及最大程度地保持培養(yǎng)基的營養(yǎng)以維持細胞的生長，對每個細胞培養(yǎng)工作者都很重要。培養(yǎng)基的使用依據(jù)不同的培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)方式、細胞種類的不同而存在差異。 1、細胞培養(yǎng)液的構成 細胞培養(yǎng)液指細胞生長的液體環(huán)境，一般指完全培養(yǎng)液，添加了血清、水解乳蛋白、各種添加劑等可以直接使用的培養(yǎng)液。 1.1 細胞培養(yǎng)基&血清模式 血清對于在傳統(tǒng)培養(yǎng)基配方中生長和增殖的大多數(shù)細胞系來說是需要的，因為大多數(shù)單獨的培養(yǎng)基并不能提供細胞生長所需要的全部營養(yǎng)，如MEM培養(yǎng)基，較為常用的量為5%～10%的比例，而特殊的低血清培養(yǎng)基血清量可降至3%左右，細胞的形態(tài)和功能不受影響。   圖1 BHK21-13第14代，MEM SLM培養(yǎng)基(SLM120)+3%NBS，100× 注：SLM120為清大天一公司低血清培養(yǎng)基，上圖為培養(yǎng)24小時細胞密度，下圖為48小時細胞密度。 血清可在培養(yǎng)基滅菌后加入，也可與培養(yǎng)基混合后一起過濾。血清的添加一方面補充了細胞生長、增殖所需的一些因子(如生長因子等)，另一方面也增加了培養(yǎng)基的黏滯度，這樣可以降低細胞在懸浮培養(yǎng)中或被胰蛋白酶消化后的損傷。 但是血清的加入也帶來了很多問題，血清都是批量生產，各批之間差異很大，血清含一些對細胞產生毒性的物質，如多胺氧化酶、補體、抗體、細菌毒素等都會影響細胞生長，甚至造成細胞死亡。血清的使用使得實驗和生產的標準化困難，其中的蛋白質使得某些轉基因蛋白生物藥品生產中分離純化工作很難完成。血清質量問題還會對接種病毒以及毒價產生影響，例產毒少，毒價低。 1.2 細胞培養(yǎng)基&乳歐液模式 化學合成培養(yǎng)基現(xiàn)雖已大規(guī)模使用，但在某些培養(yǎng)領域水解乳蛋白(Lactalbumin Hydrolysate )仍在使用，以補充培養(yǎng)液中缺乏的氨基酸、小肽物質。較為常用的方式是用漢氏(Hank's BSS)或歐式(Earle's BSS)平衡鹽溶液溶解水解乳蛋白(一般為5‰濃度)，即成乳漢(歐)液，再與化學合成培養(yǎng)基(一般為MEM)按比例混合使用(如1：1)。 水解乳蛋白為乳白蛋白經蛋白酶和肽酶水解的產物，含有豐富的氨基酸。既可用于細菌微生物培養(yǎng)，又可用于動物細胞培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)中一般為0.5%水解乳蛋白(經平衡鹽溶解)與合成培養(yǎng)基(如MEM)按1：1混合使用。目前在生產中主要用于地鼠腎細胞等細胞的培養(yǎng)和維持。但是水解乳蛋白的使用也給生物制品的生產帶來一定的風險。首先由于水解乳蛋白來源于動物，有可能攜帶傳染源，包括病毒和有毒物質。任何一種傳染源都可能對正在生長的細胞系或者制品帶來風險。其次水解乳蛋白及含有動物組分培養(yǎng)基的使用，使生物制品下游處理變得復雜，這對于蛋白質藥物顯得更加重要。因為用動物細胞生產生物藥品，其面臨的最大困難就是如何去除內源或同源蛋白。不確定的成分，例如動物肽類物質的引入，勢必會增加提取、分離、純化步驟，一方面使成本提高，另一方面也會影響生物制品的產量和質量。 1.3 細胞培養(yǎng)基&各類添加劑(生長因子等)模式 成分復雜的培養(yǎng)基還含有許多化合物，包括蛋白質、多肽、核苷、檸檬酸循環(huán)的中間產物、丙酮酸及脂類等。已發(fā)現(xiàn)當培養(yǎng)基中的血清濃度減少時，這些成分都是必需的。既使在使用血清的情況下，這些成分也可幫助細胞的克隆化培養(yǎng)及維持某些特殊細胞系的生長。 激素和生長因子在大多數(shù)常規(guī)培養(yǎng)基的配方中都沒有注明，但在無血清培養(yǎng)基中通常要加入它們，用其來代替血清中的激素(包括50ng/ml的生長激素和1～10U/ml的胰島素)，它們能增加多種不同類型細胞的貼瓶率;氫化可的松能提高膠質細胞、成纖維細胞的克隆形成率。生長因子包括FGF家族、EGF、PDGF、IGF-1和IGF-2及白介素等，生長因子和細胞因子有著廣泛的特異性，一般與激素或其它物質起相互協(xié)同或加成作用。 另一種常見的添加物就是血清替代物，目前已有許多可完全或部分替代傳統(tǒng)培養(yǎng)液中血清成分的商業(yè)產品，其穩(wěn)定性較好，但批次間仍有差別，產品的成分也不很確定。 2、細胞培養(yǎng)基配制 2.1 干粉培養(yǎng)基原倍液的配制 1)配制過濾除菌的細胞培養(yǎng)基 1)閱讀培養(yǎng)基使用說明，確定需要添加何種添加劑(如NaHCO3、L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉、HEPES等)。 2)根據(jù)所需將培養(yǎng)基全部倒入一容器中，用少量注射用水(20℃～30℃)將袋內殘留培養(yǎng)基洗下，并入容器。加注射用水至總體積的95%，輕微攪拌溶解。 3)加入規(guī)定量的碳酸氫鈉及所要添加的物質。 4)輕微攪拌溶解，加注射用水至規(guī)定體積。 5)用1mol/L 氫氧化鈉溶液或1mol/L鹽酸溶液調pH至所需值。 6)用0.22μm濾膜正壓過濾除菌。 7)溶液應在2℃～8℃下避光保存。 具體使用方法參照培養(yǎng)基包裝袋上的說明書。 (2) 配制可高壓滅菌細胞培養(yǎng)基 1)根據(jù)所需將培養(yǎng)基全部倒入一容器中，用少量注射用水(20℃～30℃)將袋內殘留培養(yǎng)基洗下，并入容器。加注射用水至總體積的95%，輕微攪拌溶解。 2) 在121℃、15psi下滅菌15分鐘。 3) 待溶液冷卻至室溫，加入無菌0.2mol/L L-谷氨酰胺溶液規(guī)定體積、無菌7.5%(w/v)碳酸氫鈉溶液規(guī)定體積，加注射用水(20℃～30℃)至規(guī)定體積，混勻。 4) 如果必要，用1mol/L 氫氧化鈉溶液或1mol / L鹽酸溶液調pH至所需值。 5) 溶液應在2℃～8℃下避光保存。 具體使用方法參照培養(yǎng)基包裝袋上的說明書。 3 注意事項 (1) 細胞培養(yǎng)用水一般為三蒸水(經石英蒸餾器蒸餾)或超純水，醫(yī)藥生產上一般為注射用水。 (2) 建議盡量選擇與所用量相匹配的包裝一次使用，因為包裝一旦打開，組分可能會變質或因受潮而結團。 (3) 溶解干粉培養(yǎng)基時先加入終體積90%～95%的培養(yǎng)用水，添加劑加完后再補足。 (4) 如需添加的組分較多時，某一組分完全溶解后，再添加另一組分。 (5) 待培養(yǎng)基完全溶解后再加入碳酸氫鈉，以免產生沉淀。 (6) 所有成分完全溶解后，培養(yǎng)基應立即過濾或高壓除菌，以免產生沉淀或有微生物污染。 (7) 由于除菌過濾后，pH值可能會升高0.1～0.2個單位，因此在過濾前，可將pH調至比所需值低0.1～0.2個單位。 (8) 在細胞培養(yǎng)過程中，建議不加或加少量的抗生素，如血清的濃度較低則所加抗生素的量也要相應降低一些。 (9) 建議用1N HCl或1N NaOH來調節(jié)培養(yǎng)基的pH，因為用碳酸氫鈉調pH值對培養(yǎng)液的滲透壓影響比較大。如下圖所示：  圖2 MEM SLM(SLM120)在相同pH值時所加的碳酸氫鈉、氫氧化鈉的量及所對應的培養(yǎng)液滲透壓  圖3 199(MD502)在相同pH值所加的碳酸氫鈉、氫氧化鈉的量及所對應的培養(yǎng)液滲透壓 4、滅菌方法 培養(yǎng)基的滅菌方法主要有兩種，高壓除菌及0.22um微孔濾膜過濾除菌。與過濾相比，高壓滅菌的工作強度小，成本較低，但易造成營養(yǎng)成分的流失，而且在多次加樣(無菌谷氨酰胺溶液，無菌碳酸氫鈉溶液等)過程中容易造成二次污染。大多數(shù)培養(yǎng)基采用0.1～0.2μm孔徑的微孔濾膜進行過濾滅菌，并且已成為培養(yǎng)基除菌的發(fā)展方向，它可低限度地減少培養(yǎng)基的營養(yǎng)損失。 4.1 高壓滅菌 某些培養(yǎng)基(如MEM)可進行高壓滅菌，例如清大天一的MEM培養(yǎng)基中的MD605、MD609等。這類培養(yǎng)基一般不含有L-谷氨酰胺和碳酸氫鈉，一般是在培養(yǎng)基高壓滅菌后加入L-谷氨酰胺和碳酸氫鈉的無菌的液體。另外可高壓的谷氨酸鹽(如L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)可代替L-谷氨酰胺。 可高壓滅菌的培養(yǎng)基在121℃、15psi，15分鐘的條件下完全可達到滅菌效果及營養(yǎng)成分的最小損失，不需將滅菌時間延長。為保證高壓滅菌的效果，滅菌設備的驗證很關鍵。 4.2 過濾滅菌 可供過濾滅菌使用的濾膜很多，其材料多為polyethersulphone(PES)、尼龍、多聚碳酸鹽、醋酸纖維素、硝酸纖維素、PTFE、陶瓷等。一般情況下采取正壓過濾，正壓過濾較之負壓過濾具有流速高、過濾快、不易污染，可避免蛋白質產生大量氣泡等優(yōu)點。一般使用過濾器可參照各供應商的產品說明書。 目前大多數(shù)實驗室和制藥企業(yè)采用微孔濾膜濾器(如Zeiss濾器)或立式微孔濾器(Millipore、Pall)除菌。微孔濾膜濾器為不銹鋼，中間可夾放0.22um濾膜。使用這種濾器最重要步驟是安裝濾膜及無菌過濾過程。如在使用Zeiss濾器時，先要用培養(yǎng)用水將濾膜充分潤濕，在安裝濾膜時可在其上放置一層定性濾紙再固定。消毒時旋鈕不要扭太緊，凡與空氣接觸部位都要包好(可用牛皮紙、紗布、無紡布等);高壓滅菌后，在無菌環(huán)境中立即將旋鈕扭緊。過濾除菌結束后，要打開濾器，檢查濾膜是否完整，如果濾膜破裂，需重新進行過濾除菌過程。立式微孔濾器可以選用不同的微孔濾柱體積，因為濾膜的折疊，膜面積顯著增大，液體處理量大，而且不容易發(fā)生堵塞現(xiàn)象。 5、細胞培養(yǎng)液的儲存 細胞培養(yǎng)液的儲存條件一般為2～8℃、密閉、避光保存，但要注意如下幾點： (1) 過濾后的完全培養(yǎng)液，即添加了血清、谷氨酰胺、抗生素等的培養(yǎng)液要盡快使用，一般在2～3周內使用完。 (2) 滅菌后的未加L-谷氨酰胺等添加劑的培養(yǎng)基溶液，一般可在4℃保存6～9個月，也可冷凍保存,用時解凍。 (3) 高壓除菌后的培養(yǎng)基應置4℃保存，不能因為其可耐受高溫而忽略儲存溫度。 (4) 添加了谷氨酰胺的培養(yǎng)液放置2周后，要補加和原來同樣量的谷氨酰胺，但這樣并不能消除谷氨酰胺降解產生的游離氨，建議配制好的培養(yǎng)液盡快使用。  圖4 pH為7.6時不同溫度2mM谷氨酰胺的穩(wěn)定性  圖 5 室溫下不同pH時10mM谷氨酰胺的穩(wěn)定性 (5) 添加某些生長因子、激素等添加物，可能會改變培養(yǎng)液的儲存條件，比如溫度、時間等方面的要求。 細胞培養(yǎng)基從1903年開始發(fā)展到現(xiàn)在，有199、MEM、DMEM、RPMI1640等基礎細胞培養(yǎng)基，還有低血清細胞培養(yǎng)基、無血清細胞培養(yǎng)基甚至無蛋白培養(yǎng)基，種類繁多、各具特點。在使用過程中，只有根據(jù)各類細胞培養(yǎng)基的特性、特點正確的選擇配制方法、滅菌方法、儲存方法，才能最大程度地保持細胞培養(yǎng)基的營養(yǎng)，發(fā)揮細胞培養(yǎng)基的功效。 |
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