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冷凍保存（cryopreservation）是以低溫冷凍來維持生命，或更準確地說是使生命活動暫時停止而得以延長的一種低溫生物學。 其理論基礎是當細胞內(nèi)外的溫度低得足以使其分子運動停止時，細胞代謝的各種生物化學過程也會停止。 成功的冷凍保存技術必須能夠使冷凍狀態(tài)的生命系統(tǒng)可以在溫度回升至正常時其生命活動也得到恢復并且無生物化學或結構上的損傷。 冷凍保存是IVF-ET的重要相關技術，如果不能成功地冷凍人類精子、卵子及胚胎，輔助生殖技術就不能得以完善和發(fā)展，其效益也就不能得以充分利用。 本文將對人類精子、卵子及胚胎的冷凍保存在輔助生殖技術中的應用加以介紹。 一、精子冷凍 （sperm cryopreservation） 精子冷凍的成功始于Polge等在1949年意外發(fā)現(xiàn)甘油可以成為冷凍保存牛精子的有效冷凍保護劑。 隨后，許多哺乳動物精子的冷凍也以甘油為冷凍保護劑相繼成功，包括人精子冷凍在1953年的成功。 人精子冷凍保存技術的建立使輔助生殖技術的應用更為廣泛而且有重要臨床意義。 1、精子冷凍的臨床意義 精子冷凍為男性提供了短期和長期保存生殖力的選擇。 通常在如下情況時人們需要冷凍保存精子： 1) 輸精管切除術: 多數(shù)男性選擇做輸精管切除術作為永久性避孕的一種手段。 當未預料的情況發(fā)生時，比如新婚、喪子或想要更多孩子等，男性需要恢復其輸精管功能時，雖然輸精管切除術可以手術修復，但是手術費用昂貴、侵入性強、成效不穩(wěn)定。 而且，既使初步修復成功，術后疤痕組織也可能會造成輸精管堵塞。 因此，許多人會選擇在做輸精管切除術之前冷凍保存部分精子以備后用。 2) 惡性腫瘤病的治療：類似于白血病、睪丸癌和其它惡性腫瘤常常在尚未開始或完成生育的年輕人群發(fā)病，幸運的是，隨著診斷及治療手段的提高，患者的存活率提高了很多。 但是化學療法或放射療法都會嚴重影響精子的生成，有時甚至可能導致永久不育。 既使從診斷出惡性腫瘤到開始治療的時間再短，患者都還有時間安排冷凍精子以備后用。 3) 人工授精之前：當男性不育是由于精子數(shù)量輕度不夠時，可以考慮采用一或多次冷凍精子富集法而后再與新鮮的精子混合起來進行人工授精。 4) 不能在人工授精或體外受精當天提供新鮮精子時：當丈夫不能保證陪同妻子進行人工授精或體外受精時，或由于各種原因使得丈夫既使可以陪同但也可能無法保證及時采集和提供新鮮精子時，只能預先冷凍保存足夠的精子以備后需。 特別是在患者接受體外受精治療時，高度建議患者預先冷凍保存足夠的精子作為備用以保障體外受精的治療不會被意外情況下沒有新鮮精子時延誤。 5) 需要將精樣在特定實驗室做遺傳檢測：將冷凍的精樣運輸?shù)教囟▽嶒炇易鲞z傳檢測，這樣就可以避免遠離實驗室的精供體做不必要的旅行。 6) 精子供體：精子冷凍保存技術為供體捐獻精子提供了方便，是精子庫建立的前提和基礎。 2、精子冷凍的方法 目前臨床上最常用的精子冷凍液是添加了7-8%甘油的TYB冷凍保存液（TEST-yolk buffer， TYB， Irvine Scientific，）。冷凍精子的具體操作如下： 1) 采集的精樣液化后，可以直接或經(jīng)過清洗處理后，在按體積比 1:1緩慢加入精子冷凍液，用冷凍細管或小瓶冷凍分裝并標記姓名、時間、代號等，隨之迅速降溫至0-4oC 2) 可以用冷凍儀控制降溫，將分裝好的細管或小瓶裝入冷凍儀，從0oC起以每分鐘1oC的速率降溫至-30oC，再以每分鐘5oC的速率降溫至-80oC后迅速將細管或小瓶投入液氮保存 3) 可以不用冷凍儀而用液氮蒸氣，將分裝好的細管或小瓶固定在距離液氮表面 9 厘米停留約15分鐘，然后降至距液氮表面1.5厘米停留約兩小時，隨后迅速將細管或小瓶投入液氮保存 4) 保持樣品浸泡在液氮中直到取出解凍使用 人精子冷凍技術在輔助生殖領域已經(jīng)成為一個常規(guī)技術被廣泛使用，有著穩(wěn)定的冷凍解凍效果。除了精子活動力一般會減少30-50%外，尚沒有數(shù)據(jù)表面冷凍解凍對精子或從之獲得的胚胎有直接相關的傷害。 二、卵子冷凍（oocyte cryopreservation） 與精子細胞相比，卵子細胞的體積大、細胞含水多、成熟卵子染色體排列有規(guī)律、紡錘體極易被細胞內(nèi)冰晶的形成而破壞，因而冷凍卵子相對困難得多。 自人類首例從冷凍解凍卵子獲得的體外受精后代于1986年降生以來，卵子冷凍技術被廣泛關注。 在卵子冷凍最初應用的幾年里，大多數(shù)學者是將人胚胎冷凍的方法直接或稍加修改地應用到卵子冷凍上，雖然獲得了一些成功，但總體效率非常低，因而尚未成為臨床上可以常規(guī)應用的技術。雖然所得到的后代中還未見到有與卵子冷凍直接或間接相關的異常，但對于是否冷凍解凍過程本身會破壞成熟卵子減數(shù)分裂的紡錘體而導致染色體數(shù)目畸形的胚胎，仍是人們廣泛關注的問題。 近幾年來卵子冷凍有了進一步的發(fā)展和更多的臨床應用，人們正拭目以待更多的數(shù)據(jù)證明其成功的穩(wěn)定性和安全性。筆者相信在不久的幾年之內(nèi)卵子冷凍會有突破性進展而最終成為輔助生殖中的一項重要而極有意義的常規(guī)技術。 1、卵子冷凍的意義 卵子冷凍有極為重要的意義和臨床價值。 這主要表現(xiàn)在以下幾個方面： 1) 建立卵子庫從而為卵巢功能喪失的婦女提供價格不太昂貴的供體卵 2) 對需要延遲生育的婦女提供冷凍保存自身卵子的選擇 3) 為面臨化學或放射治療的惡性腫瘤患者提供保存自身卵子的機會 4) 為IVF-ET病人，尤其是對于有強烈信仰而拒絕冷凍或丟棄多余胚胎的患者，提供了冷凍保存多余卵子的選擇 5) 在 IVF-ET治療中產(chǎn)生臨床意外的情況下，包括卵子采集后沒能及時得到可用精子，或病人在取卵手術后由于各種原因不能繼續(xù)IVF-ET治療時，冷凍卵子技術為病人提供了保存卵子以備后用的機會 6) 為接受捐增卵子的夫婦提供了卵子采集后隔離留驗卵子供體傳染病（retrospective donor screening）的選擇 2、卵子冷凍的應用 目前報道使用較多的卵子冷凍方法主要有兩種：慢速冷凍法（slow freezing）和玻璃樣化冷凍法（vitrification），這兩種方法都已經(jīng)成功地在胚胎冷凍上成功應用，對于卵子冷凍，這兩種方法都有待更多臨床數(shù)據(jù)說明其成功率、穩(wěn)定性及安全性，尚無一種方法被廣泛認可。卵子冷凍技術在生殖領域中的應用還屬研究階段，商家對于其商業(yè)化的卵子冷凍液正在積極收集臨床數(shù)據(jù)，尚未面向輔助生殖醫(yī)學領域公開合理銷售。 三、胚胎冷凍 （embryo cryopreservation） 冷凍保存細胞的理論基礎在1965年就被Mazur提出。經(jīng)過幾年的探索，終于在1972年獲得了小鼠冷凍胚胎移植的成功。 隨后，冷凍胚胎移植相繼在22種哺乳動物上獲得成功。 繼人類第一例冷凍解凍胚胎移植在1983年獲得成功，人胚胎冷凍就成為IVF-ET中一項重要附屬常規(guī)技術。 根據(jù)美國疾控制中心的統(tǒng)計，在2001 年中，至少有5047位嬰兒是移植經(jīng)過冷凍-解凍的胚胎獲得的。 1、胚胎冷凍的意義 隨著超數(shù)排卵技術在IVF-ET上的應用，一次IVF-ET有時會得到10個以上，甚至20個成熟卵子，繼而得到了多余得胚胎。 如果沒有胚胎冷凍技術，為安全起見，通常病人在無可奈何的情況下不得不只移植3-4個胚胎，而被迫將多余的胚胎浪費。 因為移植過多的胚胎會引起多胎懷孕，可能最終會導致嚴重危險。 胚胎冷凍技術的成功建立避免了多余胚胎的浪費。 病人不僅可以有一次新鮮胚胎移植，還可以利用冷凍保存的多余胚胎做一次或多次的冷凍胚胎移植，增加了一次IVF-ET的效率及 病人懷孕的機會。目前，早期人胚胎可以成功地在不同發(fā)育階段被冷凍，而囊胚期胚胎冷凍技術的建立為囊胚期胚胎移植提供了方便，因而對減少移植胚胎數(shù)目繼而降低IVF-ET多胎妊娠起到了積極推動作用。 同時，當IVF-ET治療過程中出現(xiàn)意外情況始，例如，病人采卵手術后由于各種原因不宜繼續(xù)IVF-ET治療，冷凍保存技術使得病人有將胚胎保存以備后用的選擇。而對于惡性腫瘤年輕患者，在開始化學治療或放射性治療之前通過IVF將所得胚胎冷凍保存，則為病人保留了今后生兒育女的希望。 2、胚胎冷凍的方法 目前，臨床上常用的胚胎冷凍法主要包括兩個：慢速冷凍法（slow freezing）和玻璃樣化冷凍法（vitrification）。 早期人胚胎在不同發(fā)育階段，包括原核期胚胎（受精卵）、分裂期（二細胞至八細胞期）、桑椹胚期和囊胚期，都可以用這兩種方法進行冷凍。 其中，慢速冷凍法比玻璃樣化冷凍法在輔助生殖醫(yī)學中的應用更為廣泛，是大多數(shù)IVF實驗室的常規(guī)胚胎冷凍技術。 1) 慢速冷凍法：包括以PROH（propanediol，PROH）為冷凍保護劑和以甘油(glycerol)為冷凍保護劑的慢速冷凍法。 這兩種方法的冷凍、解凍溶液都含有20%的SSS（synthetic serum substitute）。 以PROH為冷凍保護劑的方法適用于原核期胚胎和分裂期胚胎的冷凍，胚胎要在含有1.5M PROH的溶液中在室溫下停留10-15分鐘，然后移入1.5M PROH、0.1M 蔗糖 的溶液中，在室溫下裝入冷凍細管或小瓶中，然后用冷凍儀按以下程序自室溫開始以每分鐘2oC降溫至-7oC，平衡10分鐘后植冰，再以每分鐘0.3oC的速度降溫至-38oC，立即投入液氮保存。解凍時， 將冷凍細管或小瓶從液氮中取出， 在空氣中停留半分鐘。再將冷凍細管或小瓶放入30oC水浴中直至冰晶消失。將冷凍細管或小瓶的內(nèi)容物放出，從中找出胚胎后將其移入含1.0M PROH、0.2M 蔗糖 的溶液中平衡5分鐘。再將胚胎移入含0.5M PROH、0.2M 蔗糖 的溶液中平衡7分鐘， 之后將胚胎移入含0.2M蔗糖 的溶液中平衡5分鐘。在將胚胎移入含10% SSS 的培養(yǎng)液使溫度從室溫回升至37oC。解凍后的胚胎可放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)目標2-4小時后進行胚胎移植。 以甘油作為冷凍保護劑的慢速法適用于囊胚期胚胎冷凍。冷凍囊胚時， 先將胚胎移入含9% 甘油和20% SSS 的培養(yǎng)液在室溫下平衡10 分鐘， 再將胚胎移入含9% 甘油，0.2M蔗糖和20% SSS 的培養(yǎng)液中并裝入冷凍細管或小瓶中。然后用冷凍儀按以下程序自室溫開始以每分鐘2oC降溫至-7oC，平衡10分鐘后植冰，然后以每分鐘0.3oC降溫至-36oC，立即投入液氮保存。解凍時， 將冷凍細管或小瓶從液氮中取出， 在空氣中停留半分鐘。再將冷凍細管或小瓶放入30 oC水浴中直至冰晶消失。將冷凍細管或小瓶的內(nèi)容物放出并從中找出胚胎后將其移入含0.5M 蔗糖 的溶液中平衡10分鐘。再將胚胎移入含0.2M 蔗糖 的溶液中平衡5分鐘。最后將胚胎移入含20% SSS 的培養(yǎng)液使溫度從室溫生至37oC。解凍后的胚胎可放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-4小時后進行胚胎移植。 2) 玻璃樣化冷凍法 含高濃度冷凍保護劑的溶液在冷凍時的固化不是通過結晶，而是通過粘度極度增加的特點，從液態(tài)變?yōu)闊o結構的玻璃狀態(tài)，這種玻璃狀態(tài)能保持其溶液狀態(tài)的分子和離子分布，被認為是一種極其粘稠的超凍液體。由于玻璃化法不產(chǎn)生細胞內(nèi)結晶，不需充分脫水，跨膜物質(zhì)濃度與滲透壓差不大，不易產(chǎn)生不可逆的細胞膜損傷而引起細胞死亡。在玻璃化冷凍液中加入大分子物質(zhì)如聚烯吡酮(PVP)或人血清白蛋白有利于形成玻璃樣化，但這些大分子物質(zhì)包被在透明帶上穩(wěn)定了透明帶上糖蛋白的結構，使其不易破裂，從而降低了在冷凍過程中滲透壓變化對胚胎的副作用。 玻璃樣化冷凍尚未成為常規(guī)冷凍方法,各實驗室也沒有統(tǒng)一的材料方法。相對來說, 胚胎冷凍微細管是一種比較容易操作的辦法。在加熱平臺上將平時冷凍胚胎用的細管拉細至內(nèi)經(jīng)約0.8 mm, 管壁約0.07 mm, 并將其從最細處切開。在玻璃樣化冷凍之前，將胚胎移入含有7.5 % 乙二醇(ethylene glycol)，7.5 % 二甲基亞砜(DMSO)和20% SSS 的PBS。三分鐘后將胚胎移入含有16.5 % 乙二醇，16.5 % 二甲基亞砜，0.5蔗糖 和10% SSS 的20 µl PBS (phosphate buffered solution) 小滴內(nèi)。再將一到三枚胚胎連同1到2 µl PBS放到細胞培養(yǎng)盤表面。然后利用毛細作用將胚胎裝入拉細的胚胎冷凍細管內(nèi)。隨后將細管立即投入液氮。 解凍時， 將冷凍細管從液氮中取出，將內(nèi)容物擠出并從中找出胚胎。讓胚胎通過1.0 M，0.75 M，0.5 M，25.0 M，0.12 M 的蔗糖濃度梯度， 每步2.5分鐘。最后將胚胎移入含10% SSS 的培養(yǎng)液并從室溫生至37oC。解凍后的胚胎可放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-4小時直至胚胎移植。 3) 胚胎冷凍的局限性 用以上不同方法冷凍解凍胚胎時,平均存活率均為50%-70%, 而并非100%的存活. 因此,胚胎經(jīng)過冷凍解凍的過程平均有大約50%-30%的損失. 而且,冷凍保護劑對胚胎是有毒性的,如果操作時間過長,胚胎的存活率就會下降. 另外，在冷凍解凍的過程中，胚胎也可能會在降溫和生溫的壓力變化下破碎，甚至丟失；有時胚胎也會部分死亡，這時其存活力也會受損； 如果需要長期保存冷凍胚胎，費用也可能會成為經(jīng)濟負擔。 在長期保存胚胎時，如果人為操縱稍不謹慎，既是是一兩秒中將冷凍細管暴露在空氣，都立即會影響胚胎的活力，因此，雖然在液氮浸泡中理論上胚胎可以存活許多年，但實際上由于保存過程中的人為因素，冷凍胚胎很容易被傷害但還不留痕跡。這些都是胚胎冷凍的局限性。
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