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Meenakshi Arora (arormx at UPMC dot EDU) University of Pittsburgh Medical Center, United States 譯者 王秀英 (mary at labome dot com) 美國新澤西州普林斯頓合原研究有限責任公司 (Synatom Research) DOI http://dx.doi.org/10.13070/mm.cn.3.175 日期 更新 : 2014-11-21; 原始版 : 2013-03-05 引用 實驗材料和方法 2013;3:175 英文摘要 A comprehensive review of cell culture media and Labome survey results on cell culture media from 720 formal publications. 簡介 細胞培養現在已成為應用于生命科學的主要技術之一，它是從動物或植物移取的細胞、組織或器官并將它們在有利于生長的人工環境中培養的統稱。細胞最適生長的基本環境要求是：控制的溫度，良好的細胞附著基質和適當的培養液和培養箱，能夠保持正確的pH值和滲透壓。在動物細胞培養中最重要和最關鍵的一步是選擇適當的培養液用于體外培養。生長培養基或培養基是液體或凝膠狀態的，設計用于支持微生物、細胞或小的植株生長。培養基是控制最佳的細胞生長最重要和最復雜的因素。細胞培養基通常包括適當的細胞能量來源和調節細胞周期的化合物。一個典型的培養基還需要補充氨基酸，維生素，無機鹽，葡萄糖，和血清，以提供生長因子，激素，和附著因子。除了營養外，培養基也有助于保持培養體系中的pH值和滲透壓平衡。 細胞培養基的類型 動物細胞的培養可以使用純天然的培養基或人工/合成的培養基混合一些天然產物。 天然培養基 天然培養基僅由天然生成的生物液體組成。天然培養基非常有用和方便，適用于多種不同的動物細胞培養。但是，由于缺乏對這些天然培養基確切成分的認識，使用天然培養基的主要缺點是可重復性差。 人工培養基 通過人為地加入一些營養物質（有機的和無機的）、維生素、鹽、O2和CO2氣體、血清蛋白、碳水化合物、輔因子，制備成人工或合成的培養基 [1] 。不同的人工培養基被分別設計用于下面的某個用途： · 及時生存（平衡的鹽溶液，有特定的pH和滲透壓） · 長時間生存（平衡鹽溶液輔以各種配方的有機化合物和/或血清） · 不確定生長 · 特定功能。 培養基種類. 用于細胞培養的各種各樣的人工培養基可以進一步分為以下四種類型： 含血清的培養基：胎牛血清是動物細胞培養基最常見的補充成分。它用來作為一種成本相對較低的補充成分，提供動物細胞培養最佳的培養基。這些補充劑能夠為不穩定或不溶于水的營養物質提供載體或螯合劑，提供激素和生長因子，蛋白酶抑制劑，并結合并中和有毒部分。 無血清培養基：培養基中含有血清存在有很多缺點，可能會成為免疫學研究中潛在的嚴重誤解的原因 [2] [3] 。為了克服使用血清的這些缺點，一些無血清培養基中已經開發出來了 [4] [5] 。這些培養基通常是專門配制的，用以單一類型細胞的培養，包含確定量的純化的生長因子、脂蛋白和其它蛋白質，而這些物質本來是由血清提供的 [6] 。這些培養基也被稱為“確定的培養基”，因為這些培養基中的物質是精確可知的。 確定化學成分的培養基：這些培養基包含無污染的超純無機和有機成分，也可能含有純蛋白質添加劑，如生長因子 [7] 。這些成分通過基因工程細菌或酵母生產，添加維生素、膽固醇、特定氨基酸和脂肪酸 [8] 。 無蛋白質培養基：無蛋白質培養基 含有任何蛋白質，僅包含用于細胞培養所必需的非蛋白成分。相比血清培養基，無蛋白培養基促進較好的細胞生長和蛋白表達，并有利于下游的表達產物純化 [9] [10] [11] 。MEM，RPMI-1640等配方不含蛋白質，需要時可補充蛋白質。 不同類型的天然和人工培養基在表一中介紹。
表一：天然的和人工合成的培養基種類。 培養基的基本組成 培養基中混合有氨基酸、葡萄糖、鹽、維生素和其他營養物質，供應商可提供粉末或液體 [12] [13]。不同的細胞系對這些組分的要求有所不同，這些差別部分是由于大量的培養基配方 [14] 。每一成分擁有一個特定的功能，如下所述： 緩沖系統 pH值調節對維持最佳培養條件是至關重要的，通常可用以下兩個緩沖系統中的一個達到這一目的： 天然緩沖系統 天然的緩沖系統中的氣態CO2與培養基中的CO3/HCO3含量維持平衡。使用天然緩沖系統進行培養需要在5％至10％CO2環境下進行，通常由CO2培養箱維持。天然的緩沖系統一般成本低、無毒 [15] 。 HEPES 化學緩沖液利用兩性離子做緩沖。HEPES在pH值范圍7.2-7.4內具有優異的緩沖能力，并且不需要受控的氣體環境 [16]。HEPES是相對昂貴的，并且在高濃度時對于某些類型的細胞是有毒的。 HEPES受到熒光照射的光敏效應誘導后大大提高了對培養基的敏感性 [17] 。 酚紅 大多數市售的培養基含有酚紅作為pH指示劑，它能夠持續監測pH值 [18] 。在細胞的生長過程中，由細胞釋放代謝物造成的pH值改變會導致培養基的顏色變化。在低pH值時，酚紅使培養基變成黃，而在較高的pH值水平時，使培養基變成紫色。介質在pH值7.4應該是亮紅色，最適合細胞培養工作。但是，使用酚紅也有一定的缺點，如下所述： · 酚紅可以模仿一些類固醇激素，特別是雌激素的作用。因此，在用到雌激素敏感的細胞，如乳腺組織做研究的時候，最好是使用不含酚紅的培養基。 · 一些無血清的配方中存在酚紅會干擾鈉-鉀平衡。這種效應可以通過在培養基中加入血清或牛垂體激素中和 · 酚紅會干擾流式細胞分析時候的檢測。 無機鹽 培養基中的無機鹽有助于保持細胞的滲透平衡，通過提供鈉、鉀和鈣離子調節膜電位 [19]. 氨基酸 由于氨基酸是蛋白質的組成部分，它們是所有已知細胞培養基的必需成分。培養基中必須包含必需氨基酸，因為細胞不能自身合成。這些是細胞增殖必需的，其濃度決定了可達到的最大細胞密度。L-谷氨酰胺，作為一種必需氨基酸，在細胞培養是及其重要的 [20] 。 L-谷氨酰胺提供NAD，NADPH和核苷酸合成的氮元素，并作為新陳代謝的二次能量來源。 L-谷氨酰胺是一種不穩定的氨基酸，隨著時間的推移，會轉換成細胞不能利用的形態，因此應該在使用前添加到培養基中 [21] 。添加比原有培養基配方更多的L-谷氨酰胺的時候要特別小心，因為它的降解會導致氨的生成，氨會對某些細胞系有害。 哺乳動物細胞培養基中的L-谷氨酰胺濃度可以從Medium 199中的0.68 mM到Dulbecco’s Modified Eagles的4 mM。無脊椎動物的細胞培養基可包含高達12.32 mM的L-谷氨酰胺。有些補充成分，如glutamax更穩定，可在長時間培養生長緩慢的細胞時替代谷氨酰胺。 非必需氨基酸也可加入到培養基中，以替代那些在生長過程中已被耗盡的成分。培養基中補充非必需氨基酸能夠刺激生長，延長細胞的生存。 糖類 糖類形式的碳水化合物是能量的主要來源。大多數培養基包含葡萄糖和半乳糖，而有一些含有麥芽糖和果糖。 蛋白質和多肽 最常用的蛋白質和肽是白蛋白、轉鐵蛋白和纖連蛋白，在無血清培養基中特別重要。血清是一種蛋白質豐富的來源，包括白蛋白、轉鐵蛋白、抑肽酶、胎球蛋白和纖維連接蛋白。白蛋白是血液中的主要蛋白，結合水，無機鹽，游離脂肪酸，激素和維生素，并將這些成分在組織和細胞間傳輸。白蛋白的結合能力使它成為從細胞培養基中去除有毒物質有效途徑。 抑肽酶是細胞培養系統中的保護劑，在中性和酸性pH值環境下穩定，耐高溫，耐蛋白水解酶降解。它對一些絲氨酸蛋白酶（如胰蛋白酶）有抑制能力。胎球蛋白是一種糖蛋白，胎兒和新生兒的血清中的濃度比成人血清中高。它也是一種絲氨酸蛋白酶抑制劑。纖維連接蛋白是細胞附著的關鍵組分。轉鐵蛋白是一種鐵轉運蛋白，能夠為細胞膜提供鐵離子。 脂肪酸和脂質 同樣，它們在無血清培養基中是特別重要的，因為它們通常存在于血清中。 維生素 許多維生素是細胞生長和增殖必不可少的。細胞不能合成足夠數量的維生素，因此，是組織培養中重要的補充成分。血清同樣是細胞培養中維生素的主要來源，但是，培養基中也包含不同的豐富維生素，適用于某一特定細胞系的培養。維生素B群是生長刺激最常見的添加維生素。 微量元素 無血清培養基中通常會補充微量元素，來代替那些血清中的常見成分。微量元素，如銅、鋅、硒和三羧酸循環的中間產物，都是適當的細胞生長所必需的化學成分 [22] 。這些微量營養元素是許多生物過程必需的，例如酶功能的維持。 培養基補充成分 某些細胞系推薦使用的完整生長培養基還需要額外的成分，它們在基礎培養基和血清中不存在。這些成分和補充物質，有助于維持細胞增殖和細胞的正常代謝 [23] [24] 。雖然一些補充成分如激素，生長因子和信號物質是某些細胞系正常生長所需的，但最好還是要采取以下一些預防措施： 由于添加補充成分會改變完整生長培養基的滲透壓，這會對細胞生長產生不利影響，因此最好在添加補充成分后重新檢測一下滲透壓。對于大多數細胞系，最佳的滲透壓應該介于260 mOSM/kg到320 mOSM/kg之間。 添加補充成分后培養基的保質期會發生變化。含蛋白質補充物的完整培養基降解速度往往比基本培養基快。 抗生素 雖然不是細胞生長必需的，抗生素通常還是會用來控制細菌和真菌污染物生長 [25] 。常規細胞培養不建議使用抗生素，因為抗生素可以掩蓋由支原體和耐藥細菌造成的污染 [26] [27] 。此外，抗生素還會干擾敏感細胞的代謝。 培養基中的血清 血清是白蛋白、生長因子和生長抑制劑的復雜混合體 [28] 。血清是細胞培養基中最重要的組分之一，作為氨基酸、蛋白質、維生素（特別是脂溶性維生素，如A，D，E，和K）、碳水化合物、脂質、激素、生長因子、礦物質和微量元素的來源。通常會在培養基中使用胎兒和小牛來源的血清來支持細胞生長 [29] 。胎兒血清含有豐富的生長因子，適當細胞克隆和難以培養的細胞的生長 [30] 。胎兒血清被用于接觸抑制研究，因為它較低的生長促進特性。正常的生長培養基往往包含2-10％的胎兒血清。培養基中補充血清具有以下作用 [31] ： · 血清未細胞提供了基本的營養成分（在溶液中和結合到蛋白質上的）。 · 血清為生長促進和特定細胞功能提供多種生長因子和激素。 · 它提供了多種結合蛋白質，如白蛋白、轉鐵蛋白，可以攜帶其他成分進入細胞。例如：白蛋白可攜帶脂類、維生素、激素等進入細胞。 · 它還可提供蛋白質，如纖連蛋白，促進細胞附著到基質上。它提供擴散因子幫助細胞在分裂前擴散。 · 它還提供蛋白酶抑制劑，保護細胞免受降解。 · 它還提供礦物質，如Na+，K+，Zn2 +，Fe2 +等。 · 它增加培養基的粘性，因此保護細胞在懸浮培養攪拌過程中免受機械損傷。 · 它還可以作為一種緩沖液。 由于存在生長因子和酶抑制劑，血清在細胞培養中的作用是非常復雜的。不幸的是，除了提供各種功能，在組織培養中使用血清也有一些缺點 [32] [33] [10]. 表
表二：培養基中使用血清的優點和缺點。 培養基的準備 供應商那里有三種形式的培養基： 1. 粉末狀態：需要研究人員準備和滅菌。 2. 濃縮狀態：由研究人員稀釋。 3. 工作液：可直接使用不許其他操作。 粉狀介質是最便宜的，但需要進行滅菌[34] 。可取的做法是，在加入血清前先過濾除菌，因為血清存在下的發泡作用會使蛋白質變性。胎牛血清或馬血清可以在過濾后加入。培養基在使用前始終要進行無菌檢測，方法是將其放置在37℃的CO2培養箱中培養72小時，以確保該批次是未被污染的。培養基應在4℃下保存。由于培養基的部分成分是光敏感的，應貯存在黑暗環境下。 培養基的選擇標準 細胞系 細胞培養基的選擇非常重要，會顯著影響細胞培養實驗的成敗 [35]. 培養基的選擇依賴于要培養的細胞的類型和培養目的和實驗室可用的資源 [36] [37]. 不同的細胞類型有高度特異的生長要求，因此，每種類型細胞的最適培養基必須通過實驗決定 [38] [39].總體來說，MEM適用于粘附生長的細胞，而RPMI-1640適合懸浮生長細胞。表三描述了普通研究的細胞系以及推薦的生長培養基。
表三：常見細胞系以及推薦的生長培養基。 原代細胞培養 原代細胞培養提供了獨特的，有價值的研究數據，但大多數情況下細胞數是限制因素。對于這些難以培養的樣品，尤其是病人活組織切片，培養基質量是必需的。多數生命科學公司提供完整的能夠直接使用的，補充成分充足的條件培養基。這降低了污染的風險，通過減少準備步驟和需要的補充成分，也節省了時間、人力和投入。此外，所有這些培養基都進行了全面的質量控制測試，每批都會常規檢測生長促進，沒有細胞毒性以及一些物理參數，如滲透壓和pH值水平。表四描述了由不同公司提供的用于常見原代細胞培養的推薦培養基。
表四：常見原代細胞的推薦培養基。 普通細胞培養基 大多數常用的培養基包括下述的如Sigma, ATCC和Life Technologies ，都有詳細討論。 Eagle’s 最低營養培養基 (EMEM) EMEM是第一個被廣泛使用的培養基，由Harry Eagle從簡單的基礎培養基（BME）配制而成。 EMEM包含平衡鹽溶液，非必需氨基酸和丙酮酸鈉。它降低了碳酸氫鈉濃度 (1500 ml/l)，從而使用5％的CO2。由于EMEM是一個非復雜培養基，所以一般會額外補充一些添加物或更高水平的血清，使其適用于多種哺乳動物細胞。 Dulbecco’s 改進 Eagle’s 培養基 (DMEM) DMEM培養基比EMEM多幾乎2倍的氨基酸的和4倍的維生素，以及硝酸鐵，丙酮酸鈉和一些補充氨基酸。最初的制劑含有1,000 mg / L的葡萄糖，首次報道用于培養小鼠胚胎細胞。進一步的變化是4500 mg / L濃度的葡萄糖，已被證明用于培養各類細胞是最佳的。 DMEM是基礎培養基，不包含蛋白質或生長促進劑。因此，需要補充一些成分成為 “完全”培養基。最常見的是補充5-10％的胎牛血清（FBS）。 DMEM中利用碳酸氫鈉緩沖液（3.7 g/L），因此，需要人工保持二氧化碳水平以維持所需的pH值。粉末狀的培養基 含有碳酸氫鈉，因為它在粉末狀態傾向于釋放氣體。粉狀培養基需要溶解后加入3.7 g / L的碳酸氫鈉。 DMEM最初用于小鼠胚胎干細胞的培養。現在已經在原代小鼠和雞細胞，病毒蝕斑形成和接觸抑制的研究中廣泛應用。 RPMI-1640 RPMI-1640是一個通用的用于哺乳動物細胞的培養基，尤其是造血干細胞。RPMI-1640是在紐約州布法羅市的羅斯韋爾公園紀念研究所（RPMI）開發出來的。 RPMI-1640是改良的McCoy’s 5A，用于外周血淋巴細胞的長時間培養。RPMI-1640使用碳酸氫鹽緩沖系統，不同于大多數哺乳動物細胞培養基的地方在于其典型的pH8的配方。RPMI-1640支持各種各樣的細胞在懸浮液中單層生長。如果適當地補充血清或足夠的血清替代品，RPMI-1640在哺乳動物細胞的培養中應用廣泛，包括新鮮的人淋巴細胞的培養，融合實驗，雜交細胞的生長。 Ham’s 營養混合液 這些最初開發用于支持中國倉鼠卵巢（CHO）細胞的克隆產物。現在已有相當多的原有培養的改良版，包括Hams’s F-12培養基，比原來的F-10配方更復雜適用于無血清的增殖。根據培養細胞的不同，混合液配制成需要血清和不需要血清兩種。 Ham’s F-10：被證實能夠支持人二倍體細胞核白細胞的生長，用于染色體分析。 Ham’s F-12：已被證明支持原代大鼠肝細胞和大鼠前列腺上皮細胞的生長。Ham’s F-12補充25 mM HEPES提供更優化的緩沖環境。 Coon’s 改良Ham’s F-12：它幾乎兩倍于F-12的氨基酸和丙酮酸，還包括抗壞血酸。它被開發用于培養病毒融合產生的雜交細胞。 DMEM/F12：它是DMEM和Ham’s F-12的混合物，是極其豐富和復雜的培養基。支持多種類型細胞在含血清和無血清的培養基中生長。終濃度為15mM的HEPES緩沖液包含在培養基中，以補償血清減少造成的緩沖能力下降。 Iscove’s 改良 Dulbecco’s 培養基 (IMDM) IMDM是非常豐富的合成培養基，非常適合于快速增殖，高密度細胞培養。 IMDM培養基是DMEM的改良版，含有硒，跟DMEM相比含有額外的氨基酸，維生素和無機鹽。它含有硝酸鉀代替硝酸鐵，并且還含有HEPES和丙酮酸鈉。它配置為了支持淋巴細胞和雜交瘤的生長。研究表明，IMDM可以支持小鼠B淋巴細胞，從骨髓中的造血組織，脂多糖刺激B細胞，T淋巴細胞，以及各種雜交細胞。
表五：常見培養及及其應用。 細胞培養基的優化 細胞培養基組成成分的復雜性為優化培養基的個別成分提出了挑戰。多數的經典培養基是為小規模低密度的細胞培養設計的，往往需要血清作為主要營養成分。然而，生物技術產業卻要求保持高細胞密度和高細胞生產力，因此開發和優化培養基是非常關鍵的 [40] 。典型的，用于生物技術產業的培養基使不含血清的，也比傳統培養基含大量濃度更高的營養成分 [41] [42] 。培養基的優化需要考慮以下參數： 要生產的產物 所需產品的類型將決定培養基的優化策略。 對于細胞數的快速增長來說，細胞的生長速度和生存能力是至關重要的。因此，細胞培養基應支持最大程度細胞的生長，并維持細胞密度增加后的細胞活力。 用于生產病毒，不僅僅要求高細胞密度，還必須有豐富的營養來維持病毒感染后的復制。 對于重組蛋白生產，高細胞密度是必需的。然而，細胞生長所需的營養物質會與蛋白生產發生競爭。因此，要仔細確定一個給定培養基可以維持的最大細胞密度達到所需的生產力水平是非常重要的。此外，在培養基優化過程中一定不影響產品質量，也是需要考慮的重要因素。 用到的細胞株 不同細胞株因為新陳代謝不同有不同的營養需求，這就決定了培養基優化方法的差異。在生物技術工業中使用最常見的細胞株有CHO細胞，BHK-21，雜交瘤細胞，骨髓瘤細胞和正常二倍體成纖維細胞。特定細胞系具有特定的營養要求，如NS0骨髓瘤細胞需要膽固醇。正常二倍體成纖維細胞需要附著因子粘附，并且在表面生長擴散。它們的生長密度很低，因此，不需要在高濃度的營養物質。雜交瘤細胞系通常高度依賴于谷氨酰胺。他們通常在達到細胞密度高峰后沒有平臺期，生存能力會迅速下降。因此培養基的優化，從而會降低細胞活力的下降，并提高單克隆抗體的產量。 包含的制造工藝 制造工藝模式不僅會影響細胞培養基的選擇，也會影響到優化步驟。使用的不同的制造工藝是： 分批處理：單一的培養基用來維持細胞的生長和生產力。因此培養基應該營養成分豐富但需要維持細胞的生理極限。 分批補料：幾種類型的培養基根據生產階段的不同分別用于細胞培養過程中。生長培養基的設計是這樣的，在接種是細胞密度低，它的營養成分濃度也較低，但在細胞生長期間和生產早期維持細胞的快速生長。在培養達到生產階段時，單獨的比生長培養基的營養濃度更高的生產培養基也會用到。 培養基發展的挑戰 在過去的幾十年中，細胞培養基技術得到了驚人的進步。找到一個良好的細胞培養基對于細胞培養的整體效果來說非常重要的。今天的挑戰是開發復雜的細胞培養基，并可以進行單獨優化以用于一系列的細胞培養上。細胞系的多樣性以及涉及到大量的培養基成分使得這個工作非常困難。事實上，由于細胞代謝途徑的復雜性，許多成分是相互依存的，這也為復雜性更添了一層。 參考文獻 1. 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